黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、一、目的：
　　 以B16F10及其相應(yīng)肺轉(zhuǎn)移的移植瘤作為研究對象，應(yīng)用2D-DIGE的方法聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)鑒定黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，并驗(yàn)證部分蛋白的功能，以期為臨床上找到預(yù)測黑色素瘤血道轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物提供理論依據(jù)。
　　 二、內(nèi)容：
　　 1.第一部分的研究內(nèi)容主要是在小鼠B16F10的皮下移植瘤傳代過程中，發(fā)現(xiàn)若干小鼠出現(xiàn)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，我們將具有黑色素瘤轉(zhuǎn)移的肺臟進(jìn)一步移植至小鼠的鼠蹊部，并進(jìn)行傳代，獲得了穩(wěn)定傳

2、代的肺轉(zhuǎn)移移植瘤（B16M組），并比較了肺轉(zhuǎn)移移植瘤與B16F10移植瘤（B16組）之間的特性差異。
　　 2.第二部分的研究內(nèi)容主要是應(yīng)用差示凝膠電泳技術(shù)比較了B16組和B16M組之間的差異蛋白表達(dá)，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定了相關(guān)蛋白。
　　 3.第三部分的研究內(nèi)容主要是利用western blotting的方法驗(yàn)證vimentin的質(zhì)譜結(jié)果，并在70例有完整預(yù)后的惡性黑色素瘤臨床標(biāo)本上探究其臨床意義。
　　 三、方法

3、：
　　 1.第一部分：50只C57BL/6J小鼠，雌雄各半分成兩組，其中25只C57BL/6J小鼠的鼠蹊部接種B16F10單細(xì)胞懸液（B16組），另外25只接種肺轉(zhuǎn)移移植瘤的單細(xì)胞懸液（B16M組），待腫瘤直徑約為1cm左右時處死小鼠，分離收集腫瘤組織，進(jìn)行H&E染色。觀察H&E切片，計數(shù)2組的血管生成擬態(tài)密度（VMD）及微血管密度（MVD），進(jìn)行MMP-2及MMP-9的免疫組織化學(xué)染色。
　　 2.第二部分：分別提取

4、8例B16組及8例B16M組凍存腫瘤組織的蛋白，將每組8例的蛋白提取物混合在一起，進(jìn)行差示凝膠電泳。在同一塊膠上分別應(yīng)用Cy3、Cy5標(biāo)記各組樣本及Cy2標(biāo)記2組的混合樣本作為內(nèi)參，在第二塊膠上進(jìn)行反向標(biāo)記，cy2，Cy3，Cy5的激發(fā)波長分別是488/520nm，532/580nm和633/670nm，DeCyder軟件進(jìn)行膠內(nèi)和膠與膠之間的差異分析，獲得的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF

5、-MS）分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖的數(shù)據(jù)，利用MASCOT Peptide Mass Fingerprint查詢軟件搜索并鑒定差異蛋白質(zhì)。
　　 3.第三部分：應(yīng)用western blotting的方法在上述提取的每組8例的蛋白標(biāo)本中驗(yàn)證質(zhì)譜結(jié)果，并收集隨訪完整的臨床病例資料，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來進(jìn)一步探究差異蛋白的臨床意義。
　　 四、結(jié)果:
　　 1.B16M組與B16組的特性差異
　　 B16M組的腫

6、瘤組織外觀顏色變淺，呈灰白色或灰黃色，質(zhì)地呈魚肉樣，B16組的腫瘤組織呈典型的黑色，質(zhì)地較軟。通過H&E染色的觀察和MMP-2、MMP-9的免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)B16M中存在血管生成擬態(tài)（VM），且VMD較B16組顯著增高，MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率也高于后者，且B16M組有明顯色素缺失的特征，類似于臨床上的無色素黑色素瘤的表現(xiàn)，說明B16M具有高轉(zhuǎn)移高侵襲力的特質(zhì)。
　　 2.B16M組與B16組的差示凝膠電泳和質(zhì)譜

7、結(jié)果
　　 選擇2D-DIGE來替代傳統(tǒng)的2-DE篩選轉(zhuǎn)移組與原發(fā)組的差異表達(dá)蛋白，并應(yīng)用MALDI-TOF/TOF MS來鑒定差異蛋白點(diǎn)，共獲得13個轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，其中11個在B16M組中上調(diào)，2個為下調(diào)，上調(diào)的蛋白有：vimentin、PGK1、enolase1、TPI、Bip、laminin binding protein、GAPDH、myoglobin、proteasomeactivator reg alpha、β-ac

8、tin和γ-actin，下調(diào)的為2個未命名蛋白。所示蛋白其功能涉及細(xì)胞骨架、糖代謝、分子伴侶和免疫調(diào)節(jié)等多方面。
　　 3.vimentin的質(zhì)譜結(jié)果驗(yàn)證和臨床意義
　　 應(yīng)用Western Blotting方法驗(yàn)證了質(zhì)譜中vimentin的鑒定結(jié)果，并在70例臨床隨訪完整的標(biāo)本中應(yīng)用免疫組化檢測vimentin的表達(dá)，vimentin的陽性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞胞漿染成黃色，陽性細(xì)胞數(shù)>40％為高表達(dá)組，<=40％為低表達(dá)組。

9、采用卡方檢驗(yàn)檢測vimentin的高/低表達(dá)與患者各臨床病理資料之間的關(guān)系，可見vimentin的高表達(dá)與血道轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，而與年齡、性別、發(fā)病部位、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯的聯(lián)系，P值均大于0.05。
　　 五、結(jié)論:
　　 Vimentin與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，高表達(dá)的vimentin對于原發(fā)黑色素瘤來說，是血道轉(zhuǎn)移的預(yù)測因素之一。在臨床上，Vimentin不僅僅是確診黑色素瘤的標(biāo)志物，還是指導(dǎo)臨床預(yù)