以細(xì)菌群體感應(yīng)為靶標(biāo)的抑制因子篩選.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性已成為全球關(guān)注的重大難題。目前臨床上使用的抗生素都是通過直接殺死微生物或抑制微生物生長來實現(xiàn)抗感染的目的，在這種生存壓力下，細(xì)菌很容易產(chǎn)生耐藥性。顯然以傳統(tǒng)的靶點和篩選方法獲得的抗生素?zé)o法從根本上解決細(xì)菌的耐藥問題，因此，尋找治療細(xì)菌感染的新途徑已成為當(dāng)今研究的前沿和熱點。近年來，細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)研究的發(fā)展，給我們帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。研究表明缺失了群體感應(yīng)系統(tǒng)的菌株

2、其致病能力大大降低，因此篩選高效的群體感應(yīng)抑制劑有望成為解決細(xì)菌耐藥問題一個有效途徑。以細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)篩得的抗菌藥物，與傳統(tǒng)的抗生素的作用機制完全不同，只抑制細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控的致病行為，不影響細(xì)菌的生長，因此，理論上細(xì)菌不會產(chǎn)生耐藥性。本文以銅綠假單胞菌的las群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)，建立篩選模型，從化合物庫和海洋微生物中篩選群體感應(yīng)抑制因子(quorum sensing inhibitor，QSI)。 利用銅綠假單胞菌l

3、as群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的lasB基因啟動子，與報告基因gfp(綠色熒光蛋白基因)或SacB(蔗糖致死基因)，構(gòu)建融合質(zhì)粒pW-1和pW-4，轉(zhuǎn)入群體感應(yīng)系統(tǒng)缺失突變株P(guān)AO-MW1中，建立兩種高靈敏度群體感應(yīng)抑制因子篩選模型PAO-MWlpW-1和PAO-MWlpW-4；模型PAO-MWlpW-1在0.5μM3-O-C12-HSL存在下，通過熒光酶標(biāo)儀檢測GFP表達(dá)情況來篩選QSI；模型PAO-MWlpW-4可用平板法直接可視化篩選，在0

4、.2μM3-O-C12-HSL、0.2μMC4-HSL和6％的蔗糖存在時細(xì)胞致死，當(dāng)有QSI同時存在時細(xì)胞可被補救。為提高模型PAO-MWlpW-4的靈敏性，建立了一種高靈敏度的TTC活菌染色方法，在PAO-MWlpW-4篩選平板中加0.05％(w/v)的TTC，活菌代謝TTC會產(chǎn)生紅色甲瓚，而死菌不著色。 從膠州灣海泥分離海洋真菌、放線菌，小體積發(fā)酵制備粗提物，用建立的銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制因子篩選模型及已有的紫色桿菌篩選模

5、型進(jìn)行初步篩選，得3株真菌提取物具銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制活性，1株放線菌提取物具紫色桿菌群體感應(yīng)抑制活性，且在有效濃度范圍內(nèi)對細(xì)菌生長沒有影響。經(jīng)16SrDNA初步鑒定該放線菌為Streptomyces屬。進(jìn)一步研究表明，該提取物能夠顯著降低紫色桿菌受群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的紫色菌素產(chǎn)量和相關(guān)蛋白酶的表達(dá)量，且呈濃度依賴性。 利用建立的篩選模型對已有的化合物庫進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)法尼醇能夠有效抑制銅綠假單胞菌las群體感應(yīng)系統(tǒng)；在PAOlpq

6、sA-突變體中試驗表明該抑制作用與PQS系統(tǒng)無關(guān)；通過計算機模擬分析、回補試驗證明法尼醇能夠和3-O-C12-HSL信號分子競爭lasR蛋白的結(jié)合位點，從而抑制las系統(tǒng)調(diào)控的lasB、toxA等毒力相關(guān)基因和swarming行為等。通過對法尼醇類似物活性分析表明法尼醇的疏水長鏈上雙鍵的立體構(gòu)象和側(cè)鏈甲基是必要的。 綜上所述，本文建立兩個高效的銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制抑制因子篩選模型；并從海洋微生物提取物中發(fā)現(xiàn)了3株真菌提取物具