根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DREB1C基因轉(zhuǎn)化苜蓿的研究.pdf

1、此研究以本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多年篩選得到的、具有再生能力的紫花苜蓿品種“保定苜?！睘榛蜣D(zhuǎn)化的受體材料，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將從擬南芥中克隆獲得的調(diào)控植物對(duì)逆境反應(yīng)的DREB1C轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)化到“保定苜?！敝?，以期獲得具有更好抗逆性狀的苜蓿新品種。 本研究，將實(shí)驗(yàn)室原有的苜蓿組織培養(yǎng)配方進(jìn)行了改良，從而獲得了苜蓿組織培養(yǎng)再生植株的有效方案，同時(shí)，將原有的用于轉(zhuǎn)化苜蓿的表達(dá)載體進(jìn)行了改造，以便對(duì)再生的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選。初步鑒定表明，

2、目的基因DREB1C轉(zhuǎn)錄因子基因已經(jīng)整合到了苜?；蚪M上。本研究的主要結(jié)果如下： 建立了一套用于保定苜蓿組織培養(yǎng)的高效再生體系。對(duì)作為外置體的材料進(jìn)行了選擇，分別選用下胚軸和子葉作為外植體，通過(guò)對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)率進(jìn)行比較，得出了下胚軸比子葉作為外植體能獲得更好的效果。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，外植體被放在UM培養(yǎng)基和改良的SH培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30天后，比較兩種培養(yǎng)基上的愈傷組織的誘導(dǎo)率，從而進(jìn)行不同培養(yǎng)基對(duì)于誘導(dǎo)愈傷組織能力的比較。

3、 改良的SH培養(yǎng)基相對(duì)于UM培養(yǎng)基對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)更有效。同時(shí)還得出，在愈傷組織誘導(dǎo)階段，2,4-D起到了關(guān)鍵的作用，KT能輔助2,4-D發(fā)揮更好的作用。在胚狀體誘導(dǎo)階段，不同濃度的KT和水解酪蛋白被加入到培養(yǎng)基內(nèi)，以比較它們?cè)谂郀铙w的起始和成熟過(guò)程中所起的作用。培養(yǎng)20天以后，在含有0.2mg/LKT和2g/L水解酪蛋白的UM培養(yǎng)基上，得到了最大的胚狀體誘導(dǎo)率。水解酪蛋白的加入提高了胚狀體的成熟率和質(zhì)量。含有15g/L蔗糖的1

4、/2MS培養(yǎng)基對(duì)于生根是很有效的。 為了便于轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)，利用重疊延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR，SOEPCR)方法克隆來(lái)自于水母的綠色熒光蛋白基因(GFP)和來(lái)自于擬南芥的目的基因DREB1C轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其進(jìn)行改造從而獲得了融合基因。通過(guò)酶切和連接反應(yīng)，將融合基因構(gòu)建到表達(dá)載體pCAMBIA1301上，獲得了具有DERB1C和GFP基因的重組表達(dá)載體pDR1-GFP，酶

5、切和測(cè)序結(jié)果表明，該融合基因與預(yù)期相符。 本實(shí)驗(yàn)所用的DREB1C轉(zhuǎn)錄因子基因，是在35s啟動(dòng)子的調(diào)控下、從擬南芥中克隆的、植物調(diào)控其自身抵抗外界逆境的信號(hào)基因。用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，將其整合到苜?；蚪M上。苜蓿的外植體放于含有目的基因及潮霉素抗性基因的載體pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌菌株GV3101中侵染。共培養(yǎng)3天后，外植體被轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(改良的SH培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基中含有2mg/L2,4-D、0.2m