丹皮酚體內(nèi)外誘導(dǎo)人食管癌Eca-109細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、食管癌(esophageal cancer，EC)是最常見的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)因癌癥死亡的病例中，食管癌居第6位。世界上食管癌每年新發(fā)病例約為30萬人，其中大約一半在中國。食管癌有腺癌(adenocarcinoma,AC)和鱗癌(squamous cellcarcinoma,SCC)兩種病理類型，中國以鱗癌多見。雖然EC的手術(shù)方法和治療有顯著的進步，但EC的預(yù)后很差。因此，探求新的有價值治療手段和策略顯得十分必要。從中藥和其他天然

2、產(chǎn)物中尋求高效、低毒的新型抗食管癌物質(zhì)并深入探討其抗腫瘤作用機制是當前國內(nèi)外研究的重要課題。 越來越多的研究表明，腫瘤與炎癥密切相關(guān)。在那些炎癥相關(guān)的腫瘤中，COX-2表達普遍上調(diào)。慢性炎癥是導(dǎo)致食管癌發(fā)生的一個重要原因，COX-2可能在其中發(fā)揮了很重要的作用。選擇性COX-2抑制劑預(yù)防腫瘤的作用已經(jīng)引起學(xué)者們的關(guān)注，針對COX-2的抗食管癌治療是目前研究的熱點。 Survivin是一種獨特的凋亡抑制基因，屬于凋亡蛋白抑

3、制因子(inhbitotapoptosis proteins，IAPs)家族。在食管癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、非小細胞肺癌和乳腺癌中呈過表達。近期研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達與食管癌對放化療的敏感性和預(yù)后有密切的聯(lián)系。 丹皮酚(Paeonol，Pae)又稱牡丹酚，是毛莨科植物牡丹Paeonia Suffruicosa Andr.根皮和蘿摩科植物徐長卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schum干燥根

4、或全草的主要有效成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，Pae具有鎮(zhèn)靜催眠、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及保護心腦血管等廣泛的藥理活性。我們在前期發(fā)現(xiàn)，Pae在體內(nèi)外具有明顯的抗腫瘤作用，本研究通過觀察Pae在體內(nèi)外對人Eca-109食管癌細胞COX-2、Survivin表達的影響，進一步探討其作用機制。 1.Pae體內(nèi)外對Eca-109細胞增殖的影響 1.1 Pae體外對Eca-109細胞增殖的影響。選用人食管鱗癌細胞株Eca

5、-109，采用MTT法檢測了Pae體外抑制人食管癌細胞株增殖的量效和時效關(guān)系。結(jié)果顯示：(1)Pae(7.81～250 mg·L-1)對細胞有增殖抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析：r=0.908，P<0.05。IC50值為98.68mg·L-1。(2)系列濃度Pae作用于細胞24h、48h及72h后觀察細胞的生長情況，結(jié)果顯示Pae作用時間越長，對上述細胞的抑制作用越強，

6、呈時間依賴性。 1.2 Pae體內(nèi)對Eca-109細胞增殖的影響。Pae 50,100和200 mg·kg-1組和CDDP 5 mg·kg-1組均能明顯抑制裸鼠皮下腫瘤的生長，抑瘤率分別為23.54％，27.91％，34.46％和58.71％，一定劑量的Pae具有抑制人Eca-109食管癌裸鼠移植瘤生長的作用，且抑瘤率隨著藥物劑量的增加逐漸升高。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關(guān)分析，r=0.974，P<0.05。 2.P

7、ae體內(nèi)外誘導(dǎo)Eca-109細胞凋亡 2.1 Pae體外誘導(dǎo)Eca-109細胞凋亡選用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(TUNEL)法，檢測細胞凋亡。采用凋亡指數(shù)分析凋亡細胞百分比，Pae作用24h后，可檢測到形態(tài)發(fā)生改變的早期凋亡細胞。24h、48h和72h時其凋亡發(fā)生率分別為(5.2±0.9)％、(14.7±1.8)％和(18.3±2.4)％與對照組(1.8±1.5)％比較，差異具有顯著性(P<0.01)。應(yīng)用流式細胞

8、儀(Flow Cytometry,FCM)檢測細胞凋亡率。Pae可誘導(dǎo)Eca-109食管癌細胞發(fā)生凋亡，在DNA直方圖上G0/Gl期前可見亞GI峰即凋亡峰，24h、48h和72h時其凋亡發(fā)生率分別為4.3％、13.1％及17.6％。其誘導(dǎo)凋亡作用呈現(xiàn)明顯時間依賴關(guān)系。 2.2 Pae體內(nèi)誘導(dǎo)Eca-109細胞凋亡TUNEL染色可發(fā)現(xiàn)棕褐色的凋亡細胞呈散在或片狀分布，Pae各劑量組的調(diào)亡指數(shù)(apoptosisindex，AI)分

9、別為(11.02±2.58)％、(19.80±2.77)％、(24.48±4.35)％和(27.13±4.39)％，與模型組(4.81±0.83)％比較，差異均有顯著性意義(P<0.05orP<0.01)。 3.Pae作用后Eca-109細胞周期變化 應(yīng)用Mcycle軟件分析Pae作用后細胞周期的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pae作用后可引起細胞周期的變化。Pae可引起人Eca-109食管癌細胞S期細胞大量堆積，G0/G1期細胞比例

10、明顯下降，細胞被阻滯在S期。 4.Pae體內(nèi)外對Eca-109細胞COX-2和SurviVin表達影響 采用免疫組化S-P法分別檢測人Eca-109食管癌細胞和裸鼠抑制瘤COX-2和Survivin的表達。運用生物圖像分析系統(tǒng)軟件分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pae體內(nèi)外均能下調(diào)COX-2和Survivin的表達。 5.結(jié)論： Pae在體外能抑制人食管癌Eca-109細胞增殖、體內(nèi)有抗裸鼠移植瘤作用，其機制可能與下調(diào)C