染料木黃酮對(duì)裸鼠卵巢癌移植瘤模型的影響.pdf

1、目的:卵巢癌是危害女性健康的三大婦科惡性腫瘤之一，由于缺乏早期診斷的方法，大多患者就診時(shí)已處于晚期階段。以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)為主的手術(shù)治療，很難做到徹底治愈，接下來需要化療來維持治療，在女性生殖道惡性腫瘤中死亡率居于首位。雖然以鉑類為主的聯(lián)合化療的應(yīng)用在多數(shù)卵巢癌中起效，但是由于長期化療的毒性作用、化療藥物耐藥及停藥后復(fù)發(fā)等問題，使化療的應(yīng)用，特別是在晚期卵巢癌的治療上受到限制，在過去30年里，患者的長期生存率沒有多少改善，患者5年生存率僅

2、為20％左右。為解決這些問題，尋找新的更好的既能殺滅腫瘤細(xì)胞又能降低系統(tǒng)毒性的聯(lián)合化療方案成為主要研究的方向。
　　 染料木黃酮，英文名稱為Genistein，化學(xué)名為4，5，7-三羥基異黃酮，為弱植物雌激素，主要存在于大豆等食物中。體內(nèi)外研究表明染料木黃酮在抑制乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長方面有巨大作用。流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，長期攝取大豆食品能降低乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、頭頸癌等的發(fā)生率，這主要?dú)w功于染料木黃酮。染料木

3、黃酮在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展階段存在著多重的抑制效應(yīng)，其抗腫瘤機(jī)制為調(diào)節(jié)雌激素受體、抑制酪氨酸蛋白激酶活性、抑制血管形成、增強(qiáng)抗氧化酶的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性等，與多種腫瘤的發(fā)生低風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。染料木黃酮也可作為一種輔助治療藥物，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，增強(qiáng)化療藥物的抗腫瘤作用，降低腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。流行病學(xué)調(diào)查、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)及抗癌機(jī)制研究等都表明，染料木黃酮具有一定程度的抑癌和防癌作用，但目前對(duì)染料木黃酮的研究

4、也有相互矛盾的結(jié)果，需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以證實(shí)。此外，尚需大樣本的、前瞻性的研究來評(píng)估染料木黃酮的抗腫瘤作用，從而為卵巢癌及其他惡性腫瘤的預(yù)防及治療提供更有力的證據(jù)。毫無疑問，大豆異黃酮類植物雌激素有著廣泛的臨床應(yīng)用前景，有待于進(jìn)一步研究。關(guān)于染料木黃酮對(duì)卵巢癌的體內(nèi)研究尚少。本實(shí)驗(yàn)以人卵巢癌裸鼠移植瘤為模型，研究了染料木黃酮及其與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用對(duì)移植瘤的影響，為染料木黃酮在卵巢癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　

5、 1細(xì)胞培養(yǎng):體外常規(guī)培養(yǎng)人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，待細(xì)胞長到對(duì)數(shù)生長期，用胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2試驗(yàn)藥物的制備:
　　 染料木黃酮的制備:Genistein由RPMI-1640配制成儲(chǔ)備液(濃度30mg/ml)，保存于-20℃冰箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)再稀釋為所需濃度(5mg/ml)。
　　 紫杉醇注射液制備:用0.9％氯化鈉注射液稀釋成3mg/ml濃度，即刻使用。
　　

6、3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用無胸腺裸小鼠，共24只，雌性，4-5周齡，體重16-20克。將SKOV3細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成25×106個(gè)/ml的濃度，無菌條件下接種于裸鼠背側(cè)近后肢處皮下，每只0.2ml。隨機(jī)分成對(duì)照組、染料木黃酮組、紫杉醇組、染料木黃酮+紫杉醇聯(lián)合用藥組。
　　 4給藥方法:接種7天后開始給藥，染料木黃酮組按照每只50mg/kg灌胃，每天一次，共四周。紫杉醇組按照每只30mg/kg給予腹

7、腔注射，每周一次，共四周。聯(lián)合用藥組按照每天給予染料木黃酮50mg/kg灌胃，每周給予紫杉醇30mg/kg腹腔注射，共四周。對(duì)照組每天灌胃相同體積的RPMI1640，每周腹腔注射相同體積的生理鹽水，共四周。
　　 5檢測(cè)指標(biāo):
　　 5.1裸鼠重量和移植瘤體積、重量:每天觀察裸鼠精神、飲食、二便，治療開始及每周末測(cè)量裸鼠體重及移植瘤的最長徑(a)及最短徑(b)，根據(jù)公式計(jì)算移植瘤體積。停藥24小時(shí)后處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織

8、，測(cè)量其重量。根據(jù)公式計(jì)算抑瘤率。
　　 5.2將腫瘤組織制作組織切片，在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 5.3用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中miRNAlet-7的表達(dá)。
　　 5.4免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中cyclinG2的表達(dá)。
　　 6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料多樣本均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。等級(jí)資料進(jìn)行秩轉(zhuǎn)換

9、后采用SNK方法兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1各組用藥對(duì)裸鼠體重、移植瘤體積、重量及抑瘤率的影響:四組裸鼠體重?zé)o明顯變化。裸鼠無明顯精神萎靡、飲食不振、腹瀉等情況。實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積增長較對(duì)照組緩慢，用藥第29天實(shí)驗(yàn)組的移植瘤體積均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合用藥組移植瘤的體積小于單一用藥組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組的移植瘤重量均小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥組的移植瘤重量小于單一用藥

10、組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥組抑瘤率高于單一用藥組。
　　 2各組腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化:各組腫瘤組織切片光鏡下可見瘤細(xì)胞具有異型性，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組異型性程度低，可見核固縮、碎裂，其中聯(lián)合用藥組最明顯。
　　 3各組腫瘤組織中miRNAlet-7的表達(dá)情況:實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中miRNAlet-7的表達(dá)均高于對(duì)照組，聯(lián)合用藥組高于單一用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4各組腫瘤組織中cyclinG2的表達(dá)情況:用藥組

11、腫瘤組織中cyclinG2的表達(dá)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥組高于單一用藥組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1用藥29天染料木黃酮組及聯(lián)合用藥組移植瘤的體積、重量均小于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合用藥組的抑瘤率高于單一用藥組，表明染料木黃酮具有抑制卵巢癌細(xì)胞生長的作用，且與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)抗腫瘤的效果。
　　 2染料木黃酮組及聯(lián)合用藥組移植瘤組織中miRNAlet-7的表達(dá)均高于對(duì)照