構(gòu)樹遺傳多樣性的AFLP研究.pdf

1、構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)主要分布于我國的西北、華北、華南、東南及西南各地，構(gòu)樹適應(yīng)性廣，萌芽力強，易繁殖，是路旁綠化與防堤護(hù)岸的重要樹種。其樹皮、木材、枝椏、葉、花、果實、種子、根、乳汁等皆可綜合利用，經(jīng)濟(jì)效益潛力很大。構(gòu)樹屬植物近20年來廣受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。
　　 AFLP(擴(kuò)增長度片段多態(tài)性)是一種新的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，以其穩(wěn)定性好、重復(fù)性高、覆蓋面廣、多態(tài)檢出率高等優(yōu)點被迅速且廣泛地運用于

2、生命科學(xué)的各領(lǐng)域中。本研究首次采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)研究構(gòu)樹種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及群體間的相互關(guān)系，并結(jié)合分布區(qū)的生境狀況，探討其遺傳多樣性和遺傳分化的影響因素，為構(gòu)樹基因資源引進(jìn)、評價、保存及遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)論如下：
　　 (1)本研究采用云南省內(nèi)的296個構(gòu)樹種質(zhì)為材料。通過對常規(guī)SDS法、常規(guī)CTAB法、SDS-CTAB結(jié)合法、改良CTAB和改良SDS法等多種提取方法對構(gòu)樹總DNA的提取效果進(jìn)行比較研

3、究，確定了改良SDS法較為適合構(gòu)樹基因組DNA的提取。此法提取的DNA其OD260/OD280值在1.8-2.0之間，且能被EcoRI和Msel酶切完全，并能獲得清晰AFLP指紋圖譜。此DNA提取方法快速、高效、經(jīng)濟(jì)，提取的DNA質(zhì)量好，特別對樣品數(shù)量多、工作量大等情況下的研究尤為適用。
　　 (2)通過對影響AFLP技術(shù)體系的各主要因素的研究，建立起適合構(gòu)樹的AFLP分析的技術(shù)體系：酶切體系30μL，總體積中含純化后的DNA4

4、μL； EcoRI和Msel各5U，分步進(jìn)行酶切；酶切完成后加入連接液，37℃連接過夜(10-12h)；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋40倍用于選擇性擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物加入4μL的雙指示劑，95℃變性5min后，在6％變性聚丙烯酰胺上恒功率(95W)進(jìn)行電泳，然后進(jìn)行銀染顯色。
　　 (3)從64對EcoRI/Msel引物中篩選出13對清晰、多態(tài)性高的引物，對296個構(gòu)樹材料的遺傳多樣性進(jìn)行了AFLP分析，都得到了清晰的指紋圖譜，并且表現(xiàn)出較好的多

5、態(tài)性。利用7對引物對不同水系與不同家系的構(gòu)樹遺傳多樣性進(jìn)行了研究，7對引物共擴(kuò)增出786條帶，平均每對引物擴(kuò)增112.3條帶，多態(tài)性條帶632條，占總帶數(shù)的80.4％。擴(kuò)增片段大小在50-450bp之間。多態(tài)性最高的為引物組合E64/M54，高達(dá)86.4％，最低的是E40/M34，多態(tài)性為75.9％，利用6對引物對不同類型構(gòu)樹遺傳多樣性進(jìn)行了研究，6對引物共擴(kuò)增出831條帶，平均每對引物擴(kuò)增138.5條帶，多態(tài)性條帶610條，占總帶數(shù)的

6、73.4％。擴(kuò)增片段大小在80-500bp之間。多態(tài)性最高的為引物組合E64/M54，高達(dá)86.4％，最低的是E44/M60，多態(tài)性為67.1％。揭示了構(gòu)樹種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性。
　　 (4)對指紋圖譜進(jìn)行判讀，構(gòu)建0、1數(shù)學(xué)矩陣。利用POPGENE32 version1.32軟件計算遺傳多樣性指數(shù)，采用NTSYS.pc2.11f計算軟件，得到相似性系數(shù)矩陣，并基于Nei's遺傳距離采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。
　　

7、 (5)在構(gòu)樹不同層次遺傳多樣性比較中，不同類型的遺傳多樣性最高，h=0.1706；而不同水系的遺傳多樣性最低，h=0.1328。居群內(nèi)的遺傳變異遠(yuǎn)高于居群間的遺傳變異，居群間分化程度低。并且不同層次的基因流值都大于2，說明基因交流防止了由遺傳漂變等引起的居群間的遺傳分化。
　　 (6)4個水系的遺傳距離分析表明，以元江水系和金沙江水系之間的遺傳距離最大(0.0098)，元江水系與怒江水系、紅河水系之間的遺傳距離最小(0.00

8、55)。從聚類圖上可以看出，在遺傳距離為0.003處取一結(jié)合線，可以將4個水系分為2大類，第一類包括元江水系、怒江水系和紅河水系；第二類為金沙江水系。
　　 (7)10個家系的遺傳距離分析表明，以石屏家系I和江川家系之間的遺傳距離最大(0.0373)，四川家系I和四川家系II遺傳距離最小(0.0030)。從聚類圖上可以看出，在遺傳距離為0.008處取一結(jié)合線，可以將10個家系分為2大類，第一個類包括怒江家系I，怒江家系II，怒江