烏飯樹葉提取物抗大鼠精神疲勞作用及其機制研究.pdf

1、精神疲勞,又稱腦力疲勞(mental fatigue),是指一種缺乏動機與警覺的主觀感覺,主要表現(xiàn)為頭腦昏沉、注意力不易集中、思考困難、健忘、欲望降低、工作效率低下、易出差錯等,給生產(chǎn)生活帶來極大影響。因此,開發(fā)能夠快速有效地緩解精神疲勞的保健食品,促進精神疲勞的快速恢復不但能夠產(chǎn)生一定的經(jīng)濟效益,還具有重要的社會意義。化學藥品和生物制品如苯丙胺、莫達菲尼、咖啡因等在延緩疲勞發(fā)生和消除疲勞方面有較好的效果,但也出現(xiàn)了許多不良反應；中國傳

2、統(tǒng)中醫(yī)藥安全有效,重視調動人體自身的抗疲勞能力,在對抗疲勞、提高工作效率方面有著得天獨厚的優(yōu)勢。目前對抗精神疲勞的中藥主要是提高免疫力、抗應激和增強學習記憶類的中成藥,如人參、西洋參、黃芪、紅景天、消疲靈顆粒等,但它們大都屬于貴重藥材,分布局限,資源有限且價格昂貴,因此難以在大范圍內推廣應用。 烏飯樹(vaccinium bracteatum thunb)為烏飯樹科植物,在我國分布很廣,蘊藏量很大。烏飯樹葉氣味苦、平、無毒,止瀉

3、除睡,強筋益氣力,自古以來就有草木之王、牛筋草、青精草的美譽。本研究首先觀察了不同劑量及不同溶劑烏飯樹葉提取物對精神疲勞的干預作用及可能的干預機制,篩選出最佳干預劑量及有效干預組份,為開發(fā)以烏飯樹葉為主的具有抗精神疲勞作用的保健食品奠定了基礎。 一、研究內容與方法： (一)大鼠精神疲勞模型的建立 SD大鼠40只隨機分為正常對照組,24h睡眠剝奪組(24h S-D組),48h睡眠剝奪組(24h S-D組)和72h睡

4、眠剝奪組(72h S-D組),每組10只。大鼠適應性喂養(yǎng)后,利用小平臺水環(huán)境的方法分別對其進行24h、48h和72h的睡眠剝奪,通過自發(fā)活動、水迷宮及負重游泳實驗評價大鼠睡眠剝奪后精神狀態(tài)的改變,以此確定導致大鼠精神疲勞的最佳睡眠剝奪時長。 (二)烏飯樹葉提取物的制備 烏飯樹葉20Kg,于4月份采于浙江省杭州市,經(jīng)第二軍醫(yī)大學天然藥化教研室鑒定為烏飯樹科烏飯樹葉。樹葉洗凈晾干后加以粉碎,用55％的乙醇于55℃的條件下,低

5、溫高壓提取3次,合并濾液,之后用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至無醇味,得烏飯樹葉醇提物。其后分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇對醇提物進行萃取,得到烏飯樹葉的氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取物,放置于-80℃冰箱內避光保存。 (三)烏飯樹葉醇提物對精神疲勞大鼠干預的量效關系研究 SD大鼠60只隨機分為正常對照組(Ⅰ組)、陰性對照組(Ⅱ組)、陽性對照組(Ⅲ組)、高劑量醇提物組(Ⅳ組)、中劑量醇提物組(Ⅴ組)、低劑量醇提物組(Ⅵ組),每組10只。

6、Ⅰ組和Ⅱ組用生理鹽水灌胃,Ⅲ組用紅景天苷溶液灌胃,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ組則用不同劑量的烏飯樹葉提取物灌胃,每組均灌胃1ml/d。接著對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組進行72h的睡眠剝奪,通過自發(fā)活動、水迷宮及負重游泳實驗評價不同溶劑干預對大鼠精神狀態(tài)的影響,并用試劑盒檢測了大鼠腦干MDA、T-AOC及SOD活性的改變；通過高效液相測定了大鼠腦干單胺類神經(jīng)遞質水平的變化,并通過MAO試劑盒檢測了與之相應的單胺氧化酶活性的改變。 (四)烏飯樹葉不同溶劑

7、提取物抗精神疲勞活性的篩選研究 SD大鼠84只隨機分為正常對照組(Ⅰ組)、陰性對照組(Ⅱ組)、陽性對照組(Ⅲ組)、水萃取物組(Ⅳ組)、氯仿萃取物組(Ⅴ組)、乙酸乙酯萃取物組(Ⅵ組)及正丁醇萃取物組(Ⅶ組),每組12只。Ⅰ組和Ⅱ組用生理鹽水灌胃,Ⅲ組用紅景天苷溶液灌胃,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ組則用不同溶劑的烏飯樹葉提取物灌胃,每組均灌胃1ml/d。接著對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組進行了72h的睡眠剝奪,通過自發(fā)活動、水迷宮及負重游泳實驗評價

8、不同溶劑干預對大鼠精神狀態(tài)的影響,并用試劑盒檢測了大鼠腦干MDA、T-AOC及SOD活性的改變。 二、結果： (一)大鼠精神疲勞模型的制備 1.自發(fā)活動實驗結果：經(jīng)過不同時間的睡眠剝奪后,與對照組相比,大鼠的自發(fā)活動次數(shù)均有所減少,其中48h S-D組與72h S-D組的活動次數(shù)與對照組相比有顯著差異(p<0.05),72h S-D組的減少更明顯；與對照組相比,大鼠的自發(fā)活動平均速度均有所減少,其中72h S-D

9、組的平均速度與對照組相比有顯著差異(p<0.05)。 2.水迷宮實驗結果：經(jīng)過不同時間的睡眠剝奪后,與對照組相比,24h S-D組和48h S-D組找到水迷宮中隱藏平臺所用的潛伏期和總路程均有所延長,游泳速度有所下降,但沒有統(tǒng)計學差異；72h S-D組的上述指標與對照組相比均有顯著差異(p<0.05),其中找到水迷宮中隱藏平臺所用的潛伏期自身前后對照也有顯著差異(p<0.05)。 3.負重游泳實驗結果：與對照組相比,大鼠

10、經(jīng)過不同時間的睡眠剝奪后,48h S-D和72h S-D組的負重游泳時間明顯縮短(P<0.01)。 (二)烏飯樹葉不同溶劑提取物20Kg烏飯樹葉經(jīng)提取后,得到醇提物為棕黑色膏狀固體455g;氯仿提取物為棕黑色膏狀固體80g：乙酸乙酯提取物為棕色粉狀固體3g;正丁醇提取物為棕黃色粉末狀固體23g;水提取物為黑色粘稠狀固體163g。 (三)烏飯樹葉醇提物對精神疲勞大鼠干預的量效關系 1、不同劑量醇提物和對照組間大鼠體重沒有顯

11、著差異。 2、對大鼠行為學的影響：與陰性對照組(Ⅱ組)相比,正常對照組(Ⅰ組)、陽性對照組(Ⅲ組)、高(Ⅳ組)、中(Ⅴ組)、低(Ⅵ組)劑量醇提物組的曠場實驗得分均高于陰性對照組(Ⅱ組),且在醇提物組問呈一定的劑量-反應關系,其中陽性對照組(Ⅲ組)、高劑量醇提物組(Ⅳ組)和中劑量醇提物組(Ⅴ組)的得分均顯著高于陰性對照組(Ⅱ組)(p<0.05),高劑量醇提物組(Ⅳ組)和中劑量醇提物組(Ⅴ組)與陽性對照組(Ⅲ組)的得分比較沒有差異；

12、Morris水迷宮主要測試大鼠睡眠剝奪前后的空間學習記憶能力,與Ⅱ組相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組找到水迷宮中的隱藏平臺所用的潛伏期均顯著少于Ⅱ組,且在醇提物組間呈一定的劑量-反應關系,其中Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組與Ⅱ組比較差異顯著(p<0.05),Ⅳ組、Ⅴ組與Ⅲ組的潛伏期比較沒有差異；與Ⅱ組相比,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組的負重游泳時間都有所延長,且在醇提物組間呈一定的劑量-反應關系,其中Ⅲ組、Ⅳ組和Ⅴ組與Ⅱ組比較差異顯著(p<0.05),Ⅳ組、Ⅴ組與

13、Ⅲ組的游泳時間比較沒有差異。與Ⅱ組相比,Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ組的曠場實驗得分、水迷宮潛伏期和負重游泳時間均沒有差異。 3、對腦干抗氧化能力影響：大鼠經(jīng)過睡眠剝奪后,與Ⅰ組比較,Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ組的脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)顯著增多(p<0.05),T-AOC及SOD水平也代償性增高(p<0.05),而Ⅲ組和Ⅳ組可顯著減少脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量(p<0.05),并使SOD活性恢復到正常水平(p<0.05)。 4、對腦干單

14、胺類遞質含量的影響：通過行為學檢測篩選抗精神疲勞效果最好的高劑量組進行檢測,結果顯示,與正常對照組比較,睡眠剝奪后,大鼠腦干內的E,NE都有降低趨勢,5-HT含量有升高趨勢,其中,陰性對照組的NE含量與正常組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05);經(jīng)過高劑量醇提物灌胃后,腦干內的E,NE含量都有所回升,5-HT含量有所下降,但尚未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。與正常對照組比較,陰性對照組的單胺氧化酶水平略有升高,但無統(tǒng)計學差異；與陰性對照組比較,高劑量醇提

15、物組對單胺氧化酶的活性也沒明顯改變。 (四)烏飯樹葉抗精神疲勞活性部位的篩選 1、不同溶劑提取物組和對照組間大鼠體重沒有顯著差異。 2、對大鼠行為學的影響：大鼠經(jīng)過72h睡眠剝奪后,與正常對照組(Ⅰ組)比較,陰性對照組的自發(fā)活動次數(shù)和空間記憶能力均出現(xiàn)顯著下降(p<0.05),負重游泳時間也明顯減少(p<0.05);與陰性對照組(Ⅱ組)比較,陽性對照組及各萃取物組的自發(fā)活動次數(shù)均顯著增多(p<0.05),陽性對照

16、組、水及氯仿萃取物組的空間記憶能力得到顯著改善(p<0.001),陽性對照組及水萃取物組可使大鼠負重游泳時間顯著延長(p<0.05);與陽性對照組(Ⅱ組)比較,水萃取物組在自發(fā)活動次數(shù)、空間記憶能力及負重游泳時間上均無顯著差異。 3、對腦干抗氧化能力的影響：大鼠經(jīng)過72h的睡眠剝奪后,與正常對照組(Ⅰ組)相比,陰性對照組(Ⅱ組)腦干內丙二醛(MDA)顯著增多(P<0.05),抗氧化酶活性也代償性升高(p<0.05),說明睡眠剝奪

17、導致了腦組織嚴重氧化應激,而陽性對照組(Ⅲ組)和烏飯樹葉水提取物組(IV組)可顯著抑制這種氧化應激反應,清除脂質過氧化產(chǎn)物的同時還可以使抗氧化物酶活性恢復至正常水平。 三結論： 1、大鼠經(jīng)過72h睡眠剝奪后,自發(fā)活動度、空間記憶能力及負重游泳時間明顯縮短,提示精神疲勞模型的復制是成功的。 2、高劑量烏飯樹葉醇提物通過降低腦內氧化應激水平,對腦內單胺類遞質水平的紊亂有一定的緩解作用,從而改善了睡眠剝奪后大鼠的精神疲