西瓜低溫響應(yīng)MYB(Cla007586)轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定及互作蛋白分析.pdf

1、西瓜（Citrullus lanatus）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培和食用的園藝作物，具有很高的經(jīng)濟價值。低溫是常見的環(huán)境脅迫因子，嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。西瓜屬于喜溫性作物，在早春和反季節(jié)設(shè)施栽培過程中，常常受到低溫脅迫，影響產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。研究西瓜低溫響應(yīng)基因的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不僅可以解析西瓜的低溫耐受性機制，也能為西瓜耐低溫品種的遺傳改良提供理論依據(jù)，具有重要的理論意義和現(xiàn)實意義。模式植物上的研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)低溫及抵御低溫過

2、程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本課題在前期研究中，從低溫脅迫下西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了一個顯著上調(diào)表達的基因Cla007586，經(jīng)鑒定為一個典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子。該MYB轉(zhuǎn)錄因子是否具有調(diào)控西瓜低溫耐受性的功能及其是如何調(diào)控的，目前尚不清楚。為回答以上問題，本研究克隆了該基因，構(gòu)建了過表達載體對煙草進行了遺傳轉(zhuǎn)化，分析了過表達煙草植株在低溫脅迫下的表型和生理生化指標(biāo)的變化，同時，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出了其在西瓜中的潛在互作蛋白。主

3、要研究結(jié)果如下:
　　1.序列分析表明，Cla007586基因是一個典型的R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子，開放閱讀框長861 bp，編碼286個氨基酸的多肽，預(yù)測分子量和等電點分別為32.6 kDa和5.79。低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量PCR分析表明，Cla007586基因受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達。
　　2.蛋白亞細胞定位表明Cla007586位于細胞核中。構(gòu)建了pK7FWG2-Cla007586植物表達載體并在本氏煙

4、草瞬時表達，通過激光共聚焦觀察煙草葉片表皮細胞發(fā)現(xiàn)，綠色熒光僅位于細胞核中，且與細胞核染料DAPI的熒光重合。
　　3.煙草轉(zhuǎn)基因植株的獲得。構(gòu)建了pHellsgate8-Cla007586植物過表達載體，利用農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化栽培煙草（Nicotiana tabacum L.cv.SR1）獲得了轉(zhuǎn)基因煙草植株，通過PCR和RT-PCR檢測，篩選了OE3和OE5過表達煙草株系，并收獲了T1代種子。
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5、過表達Cla007586基因降低了煙草植株的低溫抗性。正常培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株與野生型煙草植株的生長及表型無明顯差別。4℃低溫脅迫處理后，與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因型煙草植株葉片表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的失水萎蔫現(xiàn)象，且細胞膜損傷程度、膜脂過氧化程度均高于野生型煙草植株。
　　5.Cla007586互作蛋白的篩選。構(gòu)建了西瓜低溫脅迫下葉片均一化cDNA文庫于Y187菌株，同時構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-Cla007586并轉(zhuǎn)化Y2HGo

6、ld菌株，在確保無自激活性和對酵母菌株生長無毒性的前提下，將兩種酵母菌株混合培養(yǎng)，通過接合生殖，初步篩選出13個與Cla007586互作的蛋白。隨后從中選擇2個(A02和A10)已報道的與溫度脅迫相關(guān)的蛋白進行了重點分析。A02編碼ω-3脂肪酸去飽和酶，在模式植物中的研究表明它能催化二烯脂肪酸轉(zhuǎn)化為三烯脂肪酸，改變膜內(nèi)不飽和脂肪酸含量提高植物的低溫抗性。A10編碼熱激轉(zhuǎn)錄因子，與溫度脅迫密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組分析表明這2個基因在西瓜低溫脅迫早