戊型肝炎病毒通用性PCR引物的設(shè)計(jì)及其基因分型的研究.pdf

1、戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一種經(jīng)消化道傳播的急性病毒性肝炎,呈全球分布,以暴發(fā)流行或散發(fā)感染的形式存在。戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是其病原體,為一無(wú)包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約7.2kb,含有3個(gè)開(kāi)放讀碼框架(Open Reading Frames,ORFs):ORF1,ORF2和ORF3。根據(jù)全基因序列的差異,可將HEV分為4個(gè)基因型,以緬甸株為代表的第1基因型、以墨西哥株為代

2、表的第2基因型、以美國(guó)株為代表的第3基因型和以新中國(guó)株為代表的第4基因型,各基因型又可分為若干基因亞型。 HEV基因分型對(duì)HEV的生物學(xué)特性研究、流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗研發(fā)等均有重要意義。根據(jù)全基因序列進(jìn)行基因分型,由于采用了全部的基因信息,因此最為準(zhǔn)確。但由于全基因組測(cè)序費(fèi)時(shí)費(fèi)力,故國(guó)內(nèi)外研究者大多選取HEV部分基因序列替代全基因組進(jìn)行基因分型。目前,由于不同實(shí)驗(yàn)室用于基因分型的序列的長(zhǎng)度、位置不同,致使HEV分型不統(tǒng)一,分型結(jié)

3、果也難以互相比較,影響了HEV基因分型的可靠性和可信度。針對(duì)HEV基因分型的現(xiàn)狀,本研究通過(guò)設(shè)計(jì)HEV通用性PCR引物,逆轉(zhuǎn)錄-套式聚合酶鏈反應(yīng)(RT-nPCR)擴(kuò)增不同基因型HEV可測(cè)序長(zhǎng)片段,提高HEV基因分型的可靠性和可信度,進(jìn)一步探索統(tǒng)一HEV基因分型標(biāo)準(zhǔn)的可能性。本研究?jī)?nèi)容主要包括以下兩部分： 一、HEV通用性PCR引物的設(shè)計(jì)及其基因分型的研究 Meng等曾于1997年設(shè)計(jì)了一套HEV通用性PCR引物(MXJ引

4、物),該套引物所擴(kuò)增的5994～6294nt區(qū)段被廣泛用于HEV基因分型,且該區(qū)段后來(lái)被證實(shí)在目前5個(gè)常用的HEV基因分型區(qū)段中其與全基因組的分型結(jié)果最為相近,但該套引物與現(xiàn)有的HEV序列出現(xiàn)了不匹配。針對(duì)HEV基因分型的現(xiàn)狀,我們?cè)贛XJ引物的基礎(chǔ)上,通過(guò)分析GenBank中現(xiàn)有的82株HEV基因組全序列,于ORF2的近5端共同保守區(qū)域重新設(shè)計(jì)了一套HEV通用性套式PCR引物(HEVuPrimer),擴(kuò)增5704～6297nt區(qū)段用于

5、HEV基因分型。本研究比較了HEVuPrimer和MXJ引物與82株HEV序列的匹配情況,結(jié)果表明HEVuPrimer與HEV序列的匹配程度明顯高于MXJ引物。分別基于全基因組序列、HEVuPrimer擴(kuò)增區(qū)段和MXJ引物擴(kuò)增區(qū)段對(duì)82株HEV構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行基因分型,HEVuPrimer擴(kuò)增區(qū)段與全基因組基因分型結(jié)果完全一致,HEVuPrimer區(qū)段的分型結(jié)果較MXJ區(qū)段更為準(zhǔn)確,而且基于前者構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)在自舉值>75％范圍內(nèi)的

6、分支的數(shù)量也多于后者,表明HEVuPrimer區(qū)段可以較好地代表全基因序列進(jìn)行HEV基因分型,且HEVuPrimer比MXJ引物具有更好的應(yīng)用價(jià)值。用HEVuPrimer系統(tǒng)測(cè)試了不同基因型的HEV參考毒株,結(jié)果在預(yù)期大小片段位置(644bp)獲得特異性擴(kuò)增條帶,測(cè)序后所得序列與GenBank原序列完全一致,驗(yàn)證了其在實(shí)際工作中可擴(kuò)增出不同變異程度的HEV基因片段,有助于發(fā)現(xiàn)新的HEV變異毒株。 二、南京地區(qū)散發(fā)性HE流行病學(xué)調(diào)

7、查及病毒基因型分析 為了解南京地區(qū)散發(fā)性臟的流行病學(xué)特點(diǎn),本研究對(duì)2006年及2007年南京市第二醫(yī)院收治的316例散發(fā)性HE患者的發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查分析。發(fā)現(xiàn)散發(fā)性HE發(fā)病具有明顯季節(jié)性,316例患者中,發(fā)病人數(shù)最多是在春季(3月～5月),為142人,占病例總數(shù)的44.9％,形成一個(gè)較明顯的發(fā)病高峰；其次為冬季(12月～2月),為75人：夏季(6月～8月),為60人：秋季(9月～11月)發(fā)病人數(shù)相對(duì)最少,為39人。HE患者在性

8、別、年齡分布亦有差別,男女之比約為2.4:1,發(fā)病高峰年齡在40歲～59歲之間,占全部病例的44.3％,發(fā)病率顯著高于其他年齡組。 將HEVuPrimer用于檢測(cè)在南京地區(qū)收集的124份HEV IgM抗體陽(yáng)性的臨床血清標(biāo)本,60份檢測(cè)出特異性HEV RNA,PCR陽(yáng)性率為48.4％,測(cè)序后與GenBank中1～4基因型HEV的序列同源列隊(duì)兩端對(duì)齊后構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),并結(jié)合核苷酸同源性分析進(jìn)行基因分型。60例陽(yáng)性標(biāo)本毒株均為4型HEV,

9、且分屬于4個(gè)不同的基因亞型,核苷酸同源性為80.0％～99.9％。06年的樣本毒株分為3個(gè)基因亞型,07年則增加為4個(gè)基因亞型,并且出現(xiàn)了新的基因亞型,提示我國(guó)HEV基因變異在不斷增大且呈逐年增高的趨勢(shì)。結(jié)合以往的研究結(jié)果,我們認(rèn)為,從1986年到2007年,我國(guó)的HEV基因型的流行特征經(jīng)歷了從1型為主到1型和4型共存,再到以4型為主的變化過(guò)程,且我國(guó)4型HEV基因亞型的分布呈復(fù)雜性的特征。 總之,要統(tǒng)一HEV基因分型的標(biāo)準(zhǔn),其

10、前提是統(tǒng)一用于HEV基因分型的PCR擴(kuò)增和測(cè)序片段。該區(qū)段應(yīng)具備三個(gè)基本條件：①該區(qū)段存在一定變異程度,可以替代全基因序列進(jìn)行基因分型；②該區(qū)段側(cè)翼序列保守,易于設(shè)計(jì)PCR引物用于不同變異程度的HEV擴(kuò)增,且設(shè)計(jì)的引物能夠在實(shí)際工作中同時(shí)擴(kuò)增出不同基因型HEV毒株的基因片段；③該區(qū)段的核苷酸序列應(yīng)達(dá)到一定的長(zhǎng)度,以使基于遺傳距離所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)具有較好的可信度。我們根據(jù)上述條件所設(shè)計(jì)的HEVuPrimer可以全面準(zhǔn)確地檢測(cè)各型HEV,