兩個(gè)擬南芥NAC家族轉(zhuǎn)錄因子基因在抗病反應(yīng)調(diào)控中的功能分析.pdf

1、在植物識(shí)別病原物后激活防衛(wèi)反應(yīng)的過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著重要的作用，它通過激活或抑制防衛(wèi)基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控。NAC轉(zhuǎn)錄因子是一個(gè)植物特有的龐大家族。最近研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答及抗逆反應(yīng)中起重要作用。本研究中，分離鑒定了2個(gè)與擬南芥抗病反應(yīng)相關(guān)的NAC型轉(zhuǎn)錄因子，其中一個(gè)是新鑒定的抗病相關(guān)NAC基因DRN1(defense-relatedNAC1)，另一個(gè)是先前鑒定的抗逆相關(guān)NAC基因ATAF1，并研究了

2、這兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在抗病反應(yīng)調(diào)控中的功能。 在分析基因芯片數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)DRN1基因在灰霉病菌(Botrytis incerea)、Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000侵染及水楊酸(salicylic acid，SA)、flg22等處理后上調(diào)表達(dá)，暗示DRN1可能與抗病反應(yīng)有關(guān)。DRN1編碼一個(gè)含275個(gè)氨基酸的蛋白，含有一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域。GFP融合蛋白分析顯示，DRN1定

3、位于細(xì)胞核內(nèi)。轉(zhuǎn)錄激活活性分析結(jié)果表明，DRN1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，而且其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C-端。promoter::GUS染色結(jié)果顯示，DRN1在正常擬南芥植株莖、葉、花內(nèi)均有表達(dá)。RT-PCR分析結(jié)果表明，PstDC3000和丑cinerea侵染后DRN1表達(dá)增強(qiáng)，其中24～48hr時(shí)表達(dá)水平最為顯著；SA、ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)和苯并噻二唑(benzothiadiazo

4、le，BTH)處理后均不同程度地誘導(dǎo)DRN1的表達(dá)。 為了研究DRN1在抗病反應(yīng)中的功能，篩選獲得一個(gè)DRN1基因的T-DNA插入突變體drn1-1。在drn1-1植株中，RT-PCR檢測(cè)不到DRN1基因表達(dá)，但是drn1-1對(duì)Pst DC3000和B.cinerea侵染僅有輕微的表型改變?？紤]到NAC家族中基因冗余現(xiàn)象，構(gòu)建了過量表達(dá)的chimeric repressor載體35S::DRN1-SRDX和過量表達(dá)載體35S::

5、DRN1，并利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸蘸法導(dǎo)入擬南芥中，分別獲得7個(gè)35S::DRN1和6個(gè)35S::DRN1-SRDX的單拷貝株系，轉(zhuǎn)代選取各3個(gè)純合株系(DRN1-OE＃2、＃6和＃11及DRN1-SRDX＃1、＃3和＃8)。比較了野生型、drn1-1、DRN1-OE和DRN1-SRDX植株對(duì)B.cinerea、PstDC3000和早疫病菌(Altenariabrassicicola)的抗病性變化。噴霧接種B.cinerea、注射接種

6、PstDC300或離體葉片滴注接種A.brassicicola后，drn1-1的發(fā)病略重于野生型，DRN1-SRDX＃1、＃3和＃8植株病害明顯重于野生型，而DRN1-OE＃2、＃6和＃11植株上病害則顯著輕于野生型。接種后，DRN1-SRDX＃1、＃3和＃8植株葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和PstDC3000菌量顯著高于野生型對(duì)照，而DRN1-OE＃2、＃6和＃11植株葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和PstDC3000菌量顯著低于野

7、生型對(duì)照。B.cinerea侵染后，DRN1-SRDX＃1和＃8植株中PR-1和PR-5基因表達(dá)上調(diào)，DRN1-OE＃2和＃11植株中PDF1.2和BIK1基因表達(dá)上調(diào)；而PstDC3000侵染后，DRN1-SRDX＃1和＃8植株中PDF1.2基因表達(dá)上調(diào)，DRN1-OE＃2和＃11植株中PR-1和PR-5以及NPR1基因表達(dá)上調(diào)。此外，DRN1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株增強(qiáng)了對(duì)ABA的敏感性。這些結(jié)果表明，DRN1在擬南芥對(duì)不同類型病害的抗病反

8、應(yīng)中起正調(diào)控作用。 ATAF1基因編碼一個(gè)含289個(gè)氨基酸的蛋白，含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域。RT-PCR結(jié)果表明，B.cinerea和PstDC3000侵染后，野生型植株中ATAF1表達(dá)受到抑制，表達(dá)水平逐漸下降；同樣，SA、BTH、ACC和JA處理也不同程度抑制ATAF1的表達(dá)。在接種B.cinerea和PstDC3000后，ATAF1的T-DNA插入突變體ataf1植株上病害水平略低于野生型，但不顯著。為了克服NAC家族基

9、因冗余引起功能研究上的困難，構(gòu)建過量表達(dá)的chimericrepressor載體35S::ATAF1-SRDX和過量表達(dá)載體35S::ATAF1，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸蘸法導(dǎo)入擬南芥中，經(jīng)轉(zhuǎn)代篩選，分別獲得2個(gè)35S::ATAF1(ATAF1-OE＃1和＃7)和2個(gè)35S::ATAF1-SRDX(ATAF1-SRDX＃3和＃10)的單拷貝株系。分析了野生型、ataf1、ATAF1-OE和ATAF1-SRDX植株對(duì)B.cinerea、P

10、st DC3000和A.brassicicola的抗病性變化。噴霧接種B.cinerea、注射接種PstDC300或離體葉片滴注接種A.brassicicola后，ataf1的發(fā)病略輕于野生型，ATAF1-SRDX＃3和＃10植株病害癥狀明顯輕于野生型，而ATAF1-OE＃1和＃7植株上病害則顯著重于野生型。接種后，ATAF1-SRDX＃3和＃10植株葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和PstDC3000菌量顯著低于野生型對(duì)照，而ATAF1

11、-OE＃1和＃7植株葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和Pst DC3000菌量顯著高于野生量顯著高于野生型對(duì)照。B.cinerea侵染后，ATAF1-SRDX＃3和＃10植株中PR-1、PR-5和NPR1基因表達(dá)上調(diào)，ATAF1-OE＃1和＃7植株中BIK1基因表達(dá)上調(diào)：而Pst DC3000侵染后，ATAF1-SRDX＃3和＃10植株中PR-1、PR-5和NPR1基因表達(dá)上調(diào)，ATAF1-OE＃2和＃11植株中PDF1.2基因表達(dá)上調(diào)。