Wee1激酶抑制劑MK-1775抗急性淋巴細(xì)胞白血病的效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)是一種發(fā)生于淋巴造血組織的常見惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。成人ALL預(yù)后一般較差，目前常采用的聯(lián)合化療雖然能使病情獲得緩解，但多數(shù)患者最終因耐藥或者疾病復(fù)發(fā)而治療失敗。此外化療往往伴有明顯的副作用如發(fā)生感染、出血以及臟器功能受損等。異基因造血干細(xì)胞移植雖然能使部分患者治愈，但移植風(fēng)險(xiǎn)高，部分患者無法找到合適供者，移植并發(fā)癥移植物抗宿主病(GVHD)往往嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。因此尋找高效低

2、毒的藥物對(duì)于ALL治療至關(guān)重要。
　　細(xì)胞周期檢點(diǎn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)損傷DNA的修復(fù)和維護(hù)細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中起著重要作用。細(xì)胞周期調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[1]。Wee1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是一種G2/M期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換、組蛋白合成以及DNA損傷的修復(fù)[2]。Wee1在多種實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，且高表達(dá)者預(yù)后差[3]。通過RNAi抑制Wee1的表達(dá)或者藥物抑制其活性，腫瘤細(xì)胞從S期或G2期提前進(jìn)

3、入M期，未完成DNA的合成和修復(fù)，表現(xiàn)為細(xì)胞組蛋白合成異常，二極紡錘體形成障礙，染色體分散存在，最終退出有絲分裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡，稱作“有絲分裂障礙”或者“有絲分裂災(zāi)難”(mitotic catastrophe)”[4]。MK-1775是一種選擇性Wee1激酶抑制劑，在乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、髓系白血病等多種腫瘤中表現(xiàn)出抗腫瘤活性[3，5-8]。因此Wee1有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。然而目前Wee1和ALL的關(guān)系還未見報(bào)道。
　　A

4、KT/mTOR和Notch通路與ALL的關(guān)系。在ALL中mTOR通路通常被活化[9]。mTOR的Ser2448位點(diǎn)被AKT磷酸化而活化，活化的mTOR通過磷酸化下游40S核糖體S6蛋白激酶參與調(diào)節(jié)目的基因的翻譯，促進(jìn)細(xì)胞存活、增生、血管生成和化療耐藥。AKT抑制劑MK2206或者mTOR抑制劑雷帕霉素能通過抑制該通路表現(xiàn)出一定的抗白血病效應(yīng)[10]。Notch是另一條在進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路。在哺乳動(dòng)物中，Notch通路由配體(J

5、agged1，Jagged2，DLL1，DLL3和DLL4)、受體(Notch1-4)和靶分子(Hes1、Hes5)組成。Notch分子由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。在活化過程中經(jīng)過3次裂解，其胞內(nèi)段Notch-IC結(jié)合RBPJK(也稱作CSL和CBF-1)，活化靶基因Hes轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生和分化。根據(jù)細(xì)胞類型和腫瘤環(huán)境的不同，Notch在不同組織中表現(xiàn)出不同的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)Notch1的活化突變可以出現(xiàn)

6、在所有亞型的T-ALL中，包括有TAL1，HOX11，HOX11 L2，LYL1，MLL-ENL和AF10-CALM基因的T-ALL中?；罨腘otch受體通過靶蛋白Hes調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[11]。在T-ALL中，Notch活化促進(jìn)T-ALL細(xì)胞的增生、浸潤(rùn)和化療耐藥，促進(jìn)白血病的發(fā)生和進(jìn)展，是一種促癌基因[12]。在B-ALL中，該通路的作用研究較少，與B-ALL發(fā)生的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。此外，mTOR和Notch信號(hào)通路均不

7、是孤立存在的，兩者可發(fā)生相互聯(lián)系。如mTOR可通過上調(diào)Notch1通路影響細(xì)胞分化是腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[13]。
　　Wee1是否與急性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病相關(guān)，Wee1抑制劑能否發(fā)揮抗ALL的效應(yīng)，機(jī)制如何還未見報(bào)道。Wee1、mTOR、Notch都與細(xì)胞增生、存活和腫瘤預(yù)后相關(guān)，Wee1抑制劑是否通過改變PI3K/AKT/mTOR和Notch通路發(fā)揮抗白血病效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。
　　研究目的:
　　檢測(cè)Wee1在AL

8、L中的表達(dá)水平，研究Wee1激酶抑制劑MK-1775對(duì)ALL細(xì)胞活性、周期調(diào)控、凋亡的影響以及與mTOR和Notch信號(hào)通路的關(guān)系，初步闡述Wee1抑制劑MK-1775抗ALL的機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.收集初診的成人ALL患者和健康對(duì)照者的骨髓標(biāo)本，淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞，熒光定量RT-PCR檢測(cè)Wee1 mRNA在患者和對(duì)照組的表達(dá)水平。
　　2.MTT法檢測(cè)W

9、ee1抑制劑MK-1775和化療藥物阿霉素對(duì)細(xì)胞活性的影響:將ALL細(xì)胞Nalm-6、Jurkat、Sup-T1、Molt-4和正常骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5接種于96孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合培養(yǎng)24、48、72小時(shí)，MTT法檢測(cè)MK-1775對(duì)ALL細(xì)胞和HS-5活性的影響，計(jì)算細(xì)胞活性和半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Wee1激酶抑制劑MK-1775對(duì)ALL細(xì)胞周期的影響:將Na

10、lm-6和Jurkat細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，加入0nM、100nM、300nM的MK-1775，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，ModFit LT軟件計(jì)算細(xì)胞周期的變化。
　　4.AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡:ALL細(xì)胞系接種于6孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合作用，培養(yǎng)24或48小時(shí)，收集細(xì)胞，AnnexinⅤ-FITC/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢

11、測(cè)FITC/PI陽性細(xì)胞，Summit5.2軟件計(jì)算凋亡率。
　　5.Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá):ALL細(xì)胞系接種于培養(yǎng)瓶中，分別加入一定濃度的MK-1775、阿霉素或者兩者聯(lián)合作用，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，用10％ SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，Western blot檢測(cè)CDK1、p-CDK1、p-H3、PARP1、γ-H2AX、AKT、mTOR、p-mTOR、bcl-2、Notch1、Hes

12、1蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.Wee1基因在ALL組和對(duì)照組的表達(dá):Wee1 mRNA在ALL組的表達(dá)相對(duì)量=2-ΔCt(ALL)=0.15±0.08，Wee1 mRNA在對(duì)照組的表達(dá)相對(duì)量=2-△Ct(對(duì)照組)=0.09±0.05，ALL組表達(dá)高于對(duì)照組(p＜0.05)。
　　2.Wee1抑制劑MK-1775體外對(duì)細(xì)胞活性的影響:(1)MK-1775能抑制ALL細(xì)胞的活性，并且呈時(shí)間和濃度依賴性。培養(yǎng)48小

13、時(shí)，Nalm-6、Molt-4、Jurkat、Sup-T1細(xì)胞的MK-1775的IC50值分別為45.88±3.90 nM、67.60±31.80 nM、137.39±33.99 nM、347.37±95.47nM。(2)MK-1775抑制HS-5的作用較弱，MK-1775作用48小時(shí)，IC50為1472.0±304.8 nM，分別高于四種ALL細(xì)胞，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。(3)MK-1775增加ADM的抗ALL活性。加藥培養(yǎng)

14、48小時(shí)，Nalm-6細(xì)胞單純阿霉素作用組，阿霉素的IC50為0.058±0.017mg/ml，聯(lián)合100nMMK-1775治療組，阿霉素的IC50降為0.018±0.012mg/ml，p＜0.05; Jurkat細(xì)胞單純阿霉素作用，阿霉素的IC50為0.044±0.017mg/ml，聯(lián)合100nM MK-1775聯(lián)合作用組，阿霉素的IC50降為和0.003±0.0005mg/ml，p＜0.05。
　　3.Wee1抑制劑MK-17

15、75對(duì)細(xì)胞周期的影響:Nalm-6和Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)板中加入0hM、100nM、300nM的MK-1775，培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示，Nalm-6細(xì)胞G1期比例分別為39.2±9.7％、34.8±5.0％（與對(duì)照比p＞0.05）和33.3±5.4％（與對(duì)照比p＞0.05），S期比例分別為55.1±7.7％、60.2±9.6％（與對(duì)照比p＞0.05）、61.4±17.2％（與對(duì)照比p＞0.05），G2/M期比例分別為3.3

16、±2.0％、3.9±3.5％（與對(duì)照比p＞0.05）、7.2±9.0％（與對(duì)照比p＞0.05），與對(duì)照比，G1期、S期和G2/M期比值改變統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異;Jurkat細(xì)胞G1期比例分別為42.5±4.1％、43.3±7.5％（與對(duì)照比p＞0.05）、15.6±3.5％（與對(duì)照比p＜0.05），S期比例分別為42.6±6.1％和43.3±7.5％（與對(duì)照比p＞0.05）、62.6±9.6％（與對(duì)照比p＜0.05），G2/M期比例分別為12.

17、6±2.7％、14.0±3.4％（與對(duì)照比p＞0.05）和27.0±4.9％（與對(duì)照比p＜0.05），100nMMK-1775治療與對(duì)照組相比，各期無明顯變化，300nM治療與空白對(duì)照相比，G1期比值下降，S期和G2/M期比值升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.Wee1抑制劑MK-1775對(duì)細(xì)胞凋亡的影響:(1)單藥作用:ALL細(xì)胞分別與0nM、100nM、300nM的MK-1775培養(yǎng)48小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示凋亡率分別為3.4

18、6±2.25％、64.82±18.44％（與對(duì)照比p＜0.05）、88.83±7.65％（與對(duì)照比p＜0.05）;Jurkat細(xì)胞凋亡率分別為2.12±0.47％、41.26±12.30％（與對(duì)照比p＜0.05）、70.08±8.52％（與對(duì)照比p＜0.05）。不同濃度藥物作用凋亡率均高于空白對(duì)照，且隨MK-1775濃度升高而增高。(2)聯(lián)合作用:ALL細(xì)胞分別與空白藥物、0.05mg/mlADM、100nM的MK-1775、0.05m

19、g/mlADM聯(lián)合100nM的MK-1775作用24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。Nalm-6細(xì)胞凋亡率分別為2.30±1.13％、12.8±5.07％、17.15±7.89％、49.42±6.82％; Jurkat細(xì)胞凋亡率分別為3.01±1.31％、18.50±7.67％、23.25±10.87和67.16±7.67。結(jié)果顯示Nalm-6和Jurkat細(xì)胞在兩藥聯(lián)合作用時(shí)凋亡率均高于ADM和MK-1775單藥作用以及空白對(duì)照組(p＜0.

20、05)。
　　5.MK-1775對(duì)信號(hào)蛋白表達(dá)的影響:Nalm-6和Jurkat細(xì)胞分別與空白藥物、0.05mg/ml ADM、100nM的MK-1775、0.05mg/mlADM聯(lián)合100nM的MK-1775作用24小時(shí)，western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示與空白對(duì)照組相比，MK-1775治療組CDK1表達(dá)無明顯變化，p-CDK1表達(dá)減低，p-H3表達(dá)增加，裂解的PARP1增加，γ-H2AX表達(dá)增加，Notch1和H

21、es1表達(dá)下降，AKT、mTOR、p-mTOR、bcl-2蛋白無變化。阿霉素治療組與對(duì)照相比，CDK1、p-CDK1、mTOR、p-mTOR、Notch、Hes1、bcl-2均無明顯變化，p-H3表達(dá)減低。兩者聯(lián)合作用，裂解的PARP1和γ-H2AX表達(dá)高于單藥和對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.Wee1基因在ALL患者中表達(dá)高于對(duì)照組，提示W(wǎng)ee1在ALL發(fā)病中可能起著重要作用。
　　2.Wee1激酶抑制劑MK-1775

22、體外具有抗ALL效應(yīng)，呈時(shí)間和濃度依賴性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度增高而增強(qiáng);MK-1775對(duì)p53突變型和野生型ALL細(xì)胞均有效;MK-1775可增加阿霉素的抗ALL活性。
　　3.與ALL細(xì)胞相比，MK-1775抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的作用較弱。
　　4.Wee1激酶抑制劑MK-1775通過抑制CDK1磷酸化干預(yù)G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期、抑制DNA修復(fù)、增加細(xì)胞損傷，誘發(fā)有絲分裂障礙。
　　5.Wee1激酶抑制劑MK-