慢病毒介導(dǎo)的miR-126穩(wěn)定過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對豬急性心肌梗死血管生成影響及機(jī)制的研究.pdf

1、急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上，由冠狀動脈內(nèi)粥樣硬化斑塊的突然破裂，繼而出血和管腔內(nèi)血栓形成，致冠狀動脈血供急劇減少或突然中斷，使相應(yīng)區(qū)域的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血、缺氧進(jìn)而導(dǎo)致心肌壞死的臨床綜合征。
　　目前，急性心肌梗死的治療方法包括藥物治療（冠脈溶栓等）、介入治療（球囊擴(kuò)張或支架）以及冠狀動脈旁路移植術(shù)等。雖然近年來不斷涌現(xiàn)的新型治療方式和工業(yè)化設(shè)備對改

2、善急性心肌梗死的預(yù)后起到了積極的作用，但急性心肌梗死仍嚴(yán)重威脅著人類的生命，臨床上必須高度重視，緊急處理并進(jìn)一步尋求最佳治療方法。
　　眾所周知，心肌梗死的修復(fù)過程與血管的結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)密切相關(guān)，梗死區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成或殘留的血管是否重新開放，對于心肌梗死后建立良好的側(cè)支循環(huán)來改善梗死區(qū)血液供應(yīng)及梗死區(qū)心肌的存活具有非常重要的意義。血管生成是一個多步驟、且受到嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜過程，這些調(diào)控主要是通過多種因子在時間和空間上協(xié)同作用

3、，共同促進(jìn)血管生成。近年來，隨著對AMI梗死區(qū)血管新生和血管生長因子研究的不斷深入，通過調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)來刺激缺血區(qū)小血管生長，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立便成了AMI治療的十分誘人且直觀合理的方法。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSC)是一種多能成體干細(xì)胞，具有多向分化的潛能，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。BMSC具有很強(qiáng)大的旁分泌能力，它

4、們在心肌微環(huán)境中能通過自分泌或旁分泌VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)等多種促血管新生的細(xì)胞因子，刺激局部血管和心肌細(xì)胞的增生，抑制缺血區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種長度為18～26核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA，其序列高度保守，通過與靶基因序列特異性相互作用在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，與其目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3

5、’-UntranslatedRegions，3’-UTR)互補匹配發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用，參與多種生物學(xué)過程。近年來有學(xué)者認(rèn)為miRNA可以作為干細(xì)胞移植治療AMI的一個新的切入點。而miRNA-126(miR-126)是目前報道的與血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管功能密切相關(guān)的miRNA，主要在心、肺組織中高度表達(dá)，其缺失可延遲血管芽生，致血管完整性破壞。
　　我們推測miR-126通過對BMSC的調(diào)節(jié)來調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，刺激缺

6、血區(qū)血管生長，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成。為此，我們擬將穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的BMSC應(yīng)用于小型豬急性心梗模型，并對其應(yīng)用效果及作用機(jī)制進(jìn)行評估和探討，以期望為AMI治療探索一條新途徑。
　　第一部分慢病毒介導(dǎo)的miR-126穩(wěn)定過表達(dá)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立
　　目的:
　　建立BMSC的分離、培養(yǎng)方法，研究其在體外生長增殖的生物學(xué)特性及表型特征;構(gòu)建pCDH-miR-126慢病毒表達(dá)載體，建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的m

7、iR-126-BMSC。
　　方法:
　　應(yīng)用Percoll細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法分離豬骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。應(yīng)用MTT方法測定培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線，應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-miR-126，用HEK293T細(xì)胞包裝后產(chǎn)生的成熟慢病毒顆粒感染BMSC細(xì)胞，建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-126的BMSC。最后用qPCR檢測miR-126的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　原

8、代培養(yǎng)的BMSC24h內(nèi)貼壁并伸展成多角形、梭形，前3天為相對抑制期，其后細(xì)胞增殖速度逐漸加快，呈對數(shù)形式，7天左右至平臺期，細(xì)胞覆蓋率達(dá)95％左右，傳至第3代時可到106個數(shù)量級細(xì)胞，能夠滿足細(xì)胞移植數(shù)量的需要，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測BMSC的標(biāo)志，顯示CD44陽性，而CD34陰性，符合BMSC特征。
　　PCR和酶切電泳驗證pCDH-miR-126重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;經(jīng)HEK293T細(xì)胞病毒包裝，感染BMSC細(xì)胞后，miR-126-

9、BMSC表達(dá)miR-126水平明顯升高。
　　結(jié)論:
　　利用Percoll細(xì)胞分離液，采用梯度密度離心法成功分離出較為均一的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞;體外培養(yǎng)生長穩(wěn)定，傳代后細(xì)胞生長較快。
　　成功構(gòu)建pCDH-miR-126慢病毒重組質(zhì)粒，建立了穩(wěn)定表達(dá)miR-126的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞株miR-126-BMSC，為研究miR-126對豬心肌梗死血管生成的影響及機(jī)制提供了有用的細(xì)胞模型。
　　第二部分小型豬急性心肌梗死模型

10、的建立及評價
　　目的:
　　結(jié)扎小型豬冠狀動脈左前降支(Left Anterior Desending Branch，LAD)建立急性心肌梗死模型，并評價其效果。
　　方法:
　　選取實驗用小豬12只，常規(guī)全身麻醉，氣管插管，平臥于導(dǎo)管室手術(shù)臺，四肢妥善固定，并同時給予實時心電監(jiān)護(hù)、血壓監(jiān)測，置入經(jīng)食管超聲探頭，連接心臟超聲儀。全身肝素化，經(jīng)股動脈穿刺并留置鞘管，先行冠狀動脈造影（Coronary Artery

11、 Angiography，CAG）證實其左前降支及其他冠狀動脈通暢，無狹窄或閉塞等病變。左前胸局部備皮，開胸，打開心包，顯露冠狀動脈左前降支，在第一對角支遠(yuǎn)端約1.5～2cm處以縫線結(jié)扎左前降支，構(gòu)建急性心肌梗死模型。心電監(jiān)護(hù)及描圖提示多個導(dǎo)聯(lián)ST段明顯弓背向上抬高，結(jié)扎部位以遠(yuǎn)左室前壁及心尖部顏色變暗、變紫、變白，心尖部室壁運動明顯減弱或消失，冠狀動脈造影顯示左前降支完全梗阻，證明造模成功。止血，關(guān)胸。待豬自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管。

12、檢測術(shù)前及術(shù)后24h心肌損傷標(biāo)志物CK、CK-MB、cTnI等。術(shù)后2d開始進(jìn)食，術(shù)后3d內(nèi)給予抗生素。術(shù)后第2周，復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠狀動脈造影及心肌核素灌注顯像(Emssion Computed Tomography,ECT)檢查;術(shù)后第6周（實驗結(jié)束后），全麻后靜脈注射氯化鉀，處死動物，剖出心臟，取出左前降支供應(yīng)區(qū)域的缺血區(qū)及正常區(qū)左心室心肌，行相關(guān)病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　12頭小型豬中有9頭存活，成活率75

13、％。冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎、血流阻斷后，可見心電圖ST段下斜形或弓背狀抬高，持續(xù)0.5h，為急性心肌梗死心電圖表現(xiàn)。前降支結(jié)扎24h后血清心肌酶譜(CK、CK-MB、cTnI)較術(shù)前顯著增高2倍以上，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）;經(jīng)食管超聲心動圖檢查結(jié)示造模后與造模前比較實驗動物心功能明顯降低:EF、FS顯著降低，LVESD、LVEDD、LVEDV等顯著增大，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);冠狀動脈造影顯示造模后左前降支血流完全中斷

14、，TIMI血流分級為0級;ECT示前降支遠(yuǎn)段支配區(qū)域較術(shù)前明顯灌注缺損;證實心梗模型建立成功。術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列不齊，肌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核大小不甚規(guī)則，細(xì)胞分界不清楚。
　　結(jié)論:
　　利用冠狀動脈結(jié)扎法制備小型豬急性心肌梗死模型，心電監(jiān)護(hù)顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)0.5h;心肌酶學(xué)CK、CK-MB和cTnI均增高2倍以上;超聲心動圖顯示心功能顯著減低;冠狀動脈造影顯示左前降支中遠(yuǎn)段結(jié)扎部位處

15、完全閉塞;心肌ECT示前降支中遠(yuǎn)段供應(yīng)區(qū)域明顯灌注缺損。成功建立了小型豬急性心肌梗死模型。
　　第三部分 miR-126-BMSC對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管生成的影響
　　目的:
　　將miR-126-BMSC注射到小型豬心肌梗死區(qū)域，4周后通過對超聲心動圖、冠狀動脈造影、心肌核素灌注顯像、梗死區(qū)域新生血管密度及血管內(nèi)皮生長因子等相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)的觀察，探討miR-126-BMSC對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管新生的影響與機(jī)

16、制。
　　方法:
　　制模2周后，將實驗動物隨機(jī)分為3組:組Ⅰ.模型組(n=3):即對照組，對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射PBS;組Ⅱ.BMSC組(n=3):對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射BMSC;組Ⅲ.miR-126組(n=3):對梗死區(qū)心肌組織內(nèi)注射miR-126-BMSC。移植（注射）后4周復(fù)查經(jīng)食管超聲心動圖、冠脈造影及心肌核素灌注顯影，開胸取出心臟進(jìn)行心臟病理改變檢測，留取標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá);免疫組化檢測Ⅷ因子特

17、異性內(nèi)皮標(biāo)記，同時利用RT-PCR及免疫印跡測定各組中VEGF mRNA及蛋白含量。
　　結(jié)果:
　　移植4周后，經(jīng)食管超聲心動圖示BMSC組及miR-126組心功能均較移植前有明顯改善，且均與模型組存在統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，其中miR-126組EF、FS改善程度及LVEDD、LVESD減小程度要明顯高于單純BMSC移植組（p＜0.05）;冠脈造影示miR-126組梗死區(qū)有相對明顯的細(xì)小側(cè)枝形成，BMSC組及miR-1

18、26組TIMI評級高于模型組，且miR-126組高于BMSC組，存在統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05）;心肌ECT提示BMSC組及miR-126組缺損面積百分比均低于模型組，且miR-126組明顯低于BMSC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）;熒光顯微鏡檢查顯示，BMSC組和miR-126組小型豬心肌梗死區(qū)組織切片可見綠色熒光，模型組無任何熒光，細(xì)胞計數(shù)示miR-126組明顯高于BMSC組(p＜0.05);Ⅷ因子染色可見BMSC組和miR-1

19、26組缺血肌肉組織的血管新生均明顯增強(qiáng)，以miR-126組的血管密度最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。RT-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示BMSC組和miR-126組梗死區(qū)組織中VEGF mRNA及蛋白顯著高于對照組，以miR-126組表達(dá)最高（p＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　將miR-126-BMSC注射入小型豬心肌梗死區(qū)，可明顯增加該區(qū)域新生血管數(shù)量，促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，利于冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的建立，增加心肌血流量，改善