S-腺苷蛋氨酸對(duì)乙醛刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及膠原表達(dá)的影響.pdf

1、目的:肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是各種慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的中間階段,其發(fā)生與發(fā)展受多種因素調(diào)控,但其中心環(huán)節(jié)是各種刺激因子誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化及增殖,并產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),沉積于肝組織中,進(jìn)一步發(fā)展即形成肝硬化。因此,抑制HSCs的活化與增殖、誘導(dǎo)其凋亡是阻止肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵。S-腺苷蛋氨酸

2、(S-adenosyl-mehionine,SAM)是由蛋氨酸與三磷酸腺苷在腺苷蛋氨酸合成酶作用下催化合成的一種天然化合物,廣泛存在于人體各種組織和體液中,參與體內(nèi)多種生化反應(yīng),是生物甲基化反應(yīng)的必需中間體,直接為甲基受體提供甲基。另外,SAM還可通過(guò)轉(zhuǎn)硫作用在體內(nèi)合成一種重要的還原物質(zhì),即谷胱甘肽(glutathione,GSH),對(duì)抗氧自由基及炎性物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷。目前,外源性的SAM在臨床上主要被用于治療各種病因引起的肝內(nèi)膽汁淤積

3、,其機(jī)制與SAM提供甲基和轉(zhuǎn)硫基作用相關(guān)。低甲基化狀態(tài)與酒精性肝病引起的肝纖維化有密切的關(guān)系,SAM作為生物甲基化的必需中間體,在理論上有可ti影響肝纖維化的過(guò)程。本研究旨在觀察SAM對(duì)乙醛(acetaldehvde,AA)刺激的體外培養(yǎng)的大鼠HSCs增殖、形態(tài)變化以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)的影響,為SAM在臨床上用于預(yù)防和治療肝纖維化提供理論依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6),將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、乙醛對(duì)

4、照組(200μmol/L)、0.15mmol/L SAM組(0.15 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、0.5 mmol/LSAM組(0.5 mmol/L SAM+200μmol/LAA)、1.5 mmol/L SAM組(1.5mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM組(5.0 mmol/LSAM+200μmol/L AA)、15.0 mmol/L SAM組(15.0 mmol/L

5、SAM+200μmol/LAA),SAM干預(yù)培養(yǎng)lh后再加入乙醛,培養(yǎng)24h后采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。依據(jù)實(shí)驗(yàn)
　　結(jié)果,選擇其中的兩個(gè)劑量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、乙醛對(duì)照組(200μmol/L)、1.5 mmol/L SAM組(1.5 mmol/L SAM+200μmol/L AA)、5.0 mmol/L SAM組(5.0 mmol/L SAM+200μmol/LAA),SAM干預(yù)培養(yǎng)

6、1h后再加入乙醛,培養(yǎng)24h后采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western-blot檢測(cè)細(xì)胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1.倒置顯微鏡下見(jiàn)空白對(duì)照組HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)良好,呈梭形或星形。與對(duì)照組比較,乙醛對(duì)照組細(xì)胞數(shù)目增多,排列密集,細(xì)胞間間隙更小,細(xì)胞周邊偽足更多更長(zhǎng),胞體呈星形或不規(guī)則形。與乙醛對(duì)照組比較,S

7、AM干預(yù)培養(yǎng)的各組細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞間的間隙增大,細(xì)胞周邊偽足減少,細(xì)胞呈短梭型或扁平形,并隨著SAM濃度的升高,此變化更加明顯。2.Mtt法檢測(cè)結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、乙醛對(duì)照組、0.15 mmol/L SAM組、0.5 mmol/L SAM組、1.5 mmol/L SAM組、5.0mmol/L SAM組、15.0 mmol/L SAM組的吸光度值(OD值)分別為((x)±s):0.463±0.038、0.698±0.014、0.445

8、±0.026、0.415±0.029、0.391±0.012、0.342±0.024、0.223±0.025。與空白對(duì)照組比較,乙醛對(duì)照組OD值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與乙醛對(duì)照組比較,SAM干預(yù)的各組OD值均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3.RT-PCR結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、乙醛對(duì)照組、1.5 mmol/LSAM組、5.0 mmol/L SAM組Ⅰ型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為((x)±s):1.4

9、16±0.020、1.972±0.038、1.681±0.031、1.461±0.032;Ⅲ型膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為((x)±s):0.996±0.008、1.875±0.028、1.537±0.056、1.053±0.062。與空白對(duì)照組比較,乙醛對(duì)照組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與乙醛對(duì)照組比較,1.5 mmol/L SAM干預(yù)組及5.0mmol/L SAM干預(yù)組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠

10、原mRNA表達(dá)均明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。4.Western-blot結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、乙醛對(duì)照組、1.5 mmol/L組、5.0 mmol/L組Ⅰ1型膠原的相對(duì)表達(dá)量分別為((x)±s):1.109±0.070、1.298±0.101、0.970±0.058、0.829±0.030;Ⅲ型膠原的相對(duì)表達(dá)量分別為((x)±s):1.017±0.013、1.204±0.024、1.089±0.015、1.048±0.0

11、19。與空白對(duì)照組比較,乙醛對(duì)照組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)與乙醛對(duì)照組比較,1.5mmol/L SAM干預(yù)組及5.0 mmol/L SAM干預(yù)組Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)均明顯減弱,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論:SAM在體外能有效抑制乙醛刺激的HSCs的增殖及Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成,且抑制效果與SAM濃度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)關(guān)系