重組人FHIT真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其干預(yù)膽管癌細(xì)胞株QBC939增殖、凋亡及侵襲性的研究.pdf

1、序言：真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染是目前醫(yī)學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)手段。而腫瘤的發(fā)生與抑癌基因和癌基因密切相關(guān)。FHIT是一種重要的抑癌基因，在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)表達(dá)缺失。Cyclin D1為常見的癌基因，它可以促使腫瘤細(xì)胞度過細(xì)胞周期的限制點(diǎn)，如G1/S限制點(diǎn)。它們的相互調(diào)控作用，尤其是FHIT干預(yù)膽管癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲性成為本次研究的重點(diǎn)。
　　 目的：通過構(gòu)建重組人脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因真核表達(dá)質(zhì)粒，探討FHIT

2、基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞株QBC939增殖、凋亡及侵襲性的影響，并進(jìn)一步研究FHIT基因?qū)?xì)胞周期蛋白Cyclin D1的調(diào)控作用。
　　 方法：首先通過Trizol法提取新鮮標(biāo)本組織中的RNA進(jìn)行RT-PCR，將產(chǎn)物與載體pcDNA 3.1用BamH I/Xho I雙酶切純化后相連接，構(gòu)建出重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行序列鑒定。然后通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法，將構(gòu)建的FHIT-pcDNA 3.1轉(zhuǎn)染入QBC939細(xì)胞，挑選出新霉素抗性克隆并進(jìn)行

3、熒光定量RT-PCR鑒定。將實(shí)驗(yàn)對象隨機(jī)分為三組：自然對照組(NCG)、空白對照組(BCG)和實(shí)驗(yàn)組(EPG)。分別使用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測侵襲能力的變化、熒光定量RT-PCR檢測Cyclin D1 mRNA表達(dá)情況及Western Blot法檢測Cyclin D1蛋白質(zhì)表達(dá)情況。所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
　　 結(jié)果：構(gòu)建出了重組人FHIT真核表達(dá)質(zhì)粒并經(jīng)過

4、序列鑒定。熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后的QBC939細(xì)胞FHIT基因表達(dá)有限恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)組與兩個對照組比較，QBC939細(xì)胞增殖被抑制(P<0.05)，促進(jìn)了其凋亡，傳過小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少；并且Cyclin D1在基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均被下調(diào)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組人FHIT真核表達(dá)質(zhì)粒。FHIT基因可以干預(yù)QBC939細(xì)胞的增殖和凋亡，減弱其侵襲力，并能下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)水平。為膽管癌進(jìn)