膿毒癥患者血小板蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、[目的] 膿毒癥的早期診斷有助于采取更為恰當(dāng)?shù)闹委煷胧┮愿纳颇摱景Y患者的預(yù)后，但目前仍缺乏有效的預(yù)測手段。本研究應(yīng)用雙向電泳和生物質(zhì)譜鑒定的差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找膿毒癥患者血小板中差異表達(dá)蛋白，并對(duì)這些差異表達(dá)蛋白分子進(jìn)行進(jìn)一步的研究和篩選，以期尋找到膿毒癥相關(guān)的血小板特異性蛋白標(biāo)志物，同時(shí)進(jìn)一步明確膿毒癥血小板蛋白質(zhì)組病理生理變化的分子機(jī)制，以便早期采取積極措施以改善膿毒癥預(yù)后。 [方法] 新鮮血液采集自十日內(nèi)

2、未用過任何藥物的正常健康受試者以及膿毒癥確診24 h的膿毒癥患者，每份血樣都單獨(dú)處理，加入體積比10％的枸櫞酸鈉抗凝在室溫下200g離心20 min獲得富血小板血漿(PRP)。取PRP的上三分之一入新試管加入最終濃度為2.5mM的前列環(huán)素，1000g離心10min。去除血漿后，用Tyrodes-HEPES液洗滌吹懸血小板至濃度2×108/ml，室溫下孵育30min，15000g離心裂解血小板后加入20μl蛋白酶抑制劑，-80℃凍存。利用

3、固相pH梯度及SDS-PAGE二維凝膠電泳分離PLT總蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色、Imagescanner掃描、PDQuest軟件圖像分析找出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF-TOF)及Mascot查詢軟件、SwissPort數(shù)據(jù)庫鑒定差異表達(dá)蛋白。 [結(jié)果] 1．優(yōu)化獲得了重復(fù)性和分辨率較好的正常健康受試者及膿毒癥患者血小板蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳(2-DE)圖譜。 2．建立

4、了正常健康受試者與膿毒癥患者血小板2-DE差異表達(dá)圖譜。 3．采用質(zhì)譜法鑒定了2-DE圖譜上的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過MALDI-TOF-MS檢測和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜尋，成功鑒定了6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，分別為來自細(xì)胞骨架蛋白家族的Actin，cytoplasmic l；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白家族的IL-1β、EF-hand calcium-bindingdomain-containing protein7；膜受體蛋白家族的GPⅨ、GPⅡb/Ⅲa和翻譯后

5、加工蛋白Protein disulfide-isomerase A3。 [結(jié)論] 膿毒癥后血小板蛋白質(zhì)組與正常受試者相比差異顯著。應(yīng)用基于2-DE和質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)方法可全面了解血小板蛋白質(zhì)組變化規(guī)律，采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)成功鑒定了膿毒癥血小板蛋白質(zhì)組中6個(gè)差異表達(dá)蛋白，這些蛋白包括細(xì)胞骨架蛋白家族、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白家族、膜受體蛋白家族、翻譯后加工蛋白。提示聯(lián)合應(yīng)用2-DE和MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)在在篩查膿毒癥臨床診斷標(biāo)