骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)異種胰島移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性疾病。WHO資料顯示：1994年世界糖尿病患者數(shù)量為1．2億人，1997年為1．35億，2000年為1．75億，預(yù)測(cè)2010年為2．39億，2030年則可達(dá)3億。目前雖然各種口服降糖藥物和胰島素的臨床應(yīng)用，使得糖尿病急性并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率逐年下降，但尚難達(dá)到理想的糖尿病疾病控制目標(biāo)，致使糖尿病患者最終發(fā)生慢性并發(fā)癥，導(dǎo)致傷殘甚至死亡。給社會(huì)和家庭帶來(lái)極

2、大的負(fù)擔(dān)。 因此，尋找一種能在糖尿病早期治療絕大多數(shù)病人的有效方法就顯得極為重要。胰腺、胰島移植給胰島素依賴(lài)型糖尿病患者帶來(lái)了新的希望，通過(guò)胰腺或胰島移植能有效的減少或脫離胰島素和降糖藥物的應(yīng)用，從而降低低血糖及遠(yuǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生。胰腺移植屬于有血管的器官移植，手術(shù)技術(shù)難度大，并發(fā)癥發(fā)病率高，還可能發(fā)生移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD），限制了其臨床的應(yīng)用。而胰島細(xì)胞移植手術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單

3、，不僅可以避免上述問(wèn)題，而且還可以利用胰腺移植的邊緣供體。近年隨著胰島分離技術(shù)的改進(jìn)和新型免疫抑制藥物的研發(fā)，胰島細(xì)胞移植在治療胰島素依賴(lài)型糖尿病方面取得了令人矚目的成果。 2000年，加拿大醫(yī)生James Shapiro領(lǐng)導(dǎo)的Edmondon研究小組采用全新的免疫治療方案及摒棄甾體激素，使得同種胰島移植取得了突破性的進(jìn)展。目前全球多中心研究結(jié)果顯示，應(yīng)用Edmondon治療方案移植后一年有約80%的患者脫離胰島素治療。雖然同種

4、胰島移植的巨大成功為徹底醫(yī)治胰島素依賴(lài)型糖尿病重新點(diǎn)燃了希望，但是人類(lèi)供者器官和組織的嚴(yán)重短缺限制了這一治療方法的廣泛應(yīng)用。據(jù)美國(guó)的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)資料顯示，每年大約有5500例的尸體供者中，只有一小部分的胰腺可供器官移植。美國(guó)的胰島素依賴(lài)型糖尿病病人有100萬(wàn)，而且每年另有3萬(wàn)新增病例，因此，尋找新的胰島供源、有效延長(zhǎng)移植物有功能存活時(shí)間是目前臨床胰島移植面臨的主要問(wèn)題。合理使用免疫抑制藥物、誘導(dǎo)免疫耐受是解決移植排斥的可行方法。 骨

5、髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來(lái)源于骨髓的基質(zhì)細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新及組織修復(fù)能力。近年的研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以參與調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞的生長(zhǎng)和淋系細(xì)胞的發(fā)育，構(gòu)成早期淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，在體外表現(xiàn)出抑制淋巴細(xì)胞增殖的活性。MSCs的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用已經(jīng)成為移植免疫耐受誘導(dǎo)和自身免疫性疾病治療研究的熱點(diǎn)。 本課題組前期的體外研究結(jié)果顯示了MSCs在免疫負(fù)調(diào)節(jié)和維持胰島功能方面的作用，本研究利用

6、大鼠到小鼠胰島移植動(dòng)物模型，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)研究：第一部分：采用全骨髓培養(yǎng)和貼壁純化的方法獲得近交系C57BL/6小鼠原代骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，MSCs在體外擴(kuò)增后鑒定細(xì)胞的表型，用CM-DiI進(jìn)行熒光標(biāo)記，以利于體內(nèi)示蹤觀(guān)察MSCs的體內(nèi)分布。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)體外擴(kuò)增C57BL/6小鼠MSCs方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，第1～2代的MSCs細(xì)胞，經(jīng)鑒定表型及純度可應(yīng)用于后期實(shí)驗(yàn)研究。CM-DiI熒光標(biāo)記良好，標(biāo)記率高，方法簡(jiǎn)單，可以用于MSCs

7、的體內(nèi)示蹤。第二部分：用0．5 mg/mlⅪ型膠原酶灌注消化和Euro-Ficoll不連續(xù)梯度離心分離的方法制備純化的SD大鼠胰島，DTZ染色計(jì)數(shù)胰島當(dāng)量，PI/FDA熒光標(biāo)記鑒定胰島細(xì)胞活力。結(jié)果表明：每只大鼠可得到胰島約960±146 IEQ，胰島細(xì)胞活力>90%，而其純度>90%。此分離純化大鼠胰島方法可以得到數(shù)量大、純度高、活性好的胰島細(xì)胞。第三部分：CM-DiI熒光標(biāo)記的C57BL/6小鼠MSCs與300 IEQ的SD大鼠胰島

8、聯(lián)合移植入BALB/c小鼠腎包膜下，并在移植后的第0、3、5天靜脈輸注CM-DiI標(biāo)記的MSCs，移植后9天處死動(dòng)物。結(jié)果顯示：MSCs聯(lián)合胰島移植組移植后7天時(shí)平均血糖（12．64±4．1）mmol/l較單純胰島移植組（19．52±3．4）mmol/l低；熒光免疫組化證實(shí)聯(lián)合移植組仍有功能性胰島殘存；冰凍切片顯示同基因CM-DiI-MSCs主要分布在受者免疫器官，胸腺最多，其次脾臟，再次是淋巴結(jié)，肝臟未發(fā)現(xiàn)；受者脾臟T細(xì)胞亞群流式細(xì)胞

9、儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比例較單純胰島移植組低（P<0．05），CD4+/CD8+T細(xì)胞的比值較PBS對(duì)照組略有升高，但低于單純胰島移植組，CD4+CD25+雙陽(yáng)性細(xì)胞量與對(duì)照組無(wú)顯著差異。盡管有結(jié)果顯示MSCs在靈長(zhǎng)類(lèi)皮膚移植和臨床腎臟移植中均在不同程度上有誘導(dǎo)移植耐受的作用，但本研究在大鼠到小鼠移植模型中未能觀(guān)察到明顯的耐受誘導(dǎo)效果，其原因可能有：①M(fèi)SCs的治療用量問(wèn)題；②聯(lián)合應(yīng)用少量免疫抑制劑，MSCs可能作為

10、一種輔助誘導(dǎo)耐受方法，單純應(yīng)用MSCs誘導(dǎo)耐受效果不明顯；③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量偏少，數(shù)據(jù)結(jié)果分析雖然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但實(shí)際差異不大；④本身嚙齒類(lèi)動(dòng)物與非人靈長(zhǎng)類(lèi)和人類(lèi)免疫系統(tǒng)的差異。 綜上，本研究主要關(guān)注了MSCs誘導(dǎo)移植免疫耐受方面的生物學(xué)功能，以嚙齒動(dòng)物為模型研究了MSCs在體內(nèi)對(duì)移植胰島的功能和受者免疫系統(tǒng)的影響，證實(shí)了MSCs對(duì)移植胰島的保護(hù)作用及MSCs主要分布在受者免疫系統(tǒng)，為后期研究MSCs對(duì)免疫系統(tǒng)的作用及為將來(lái)豬到人異