GRP78和Calreticulin在人骨肉瘤組織中的表達(dá)及其意義.pdf

1、骨肉瘤(Osteosarcoma)是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，僅次于漿細(xì)胞瘤在原發(fā)性骨腫瘤中占第二位，以能夠產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征。多見于青少年。近30年來，隨著新輔助化療廣泛應(yīng)用，骨肉瘤的5年生存率己大大提高。骨肉瘤治療現(xiàn)在正處在一個新的階段，必須尋找骨肉瘤標(biāo)志物以判斷其生物學(xué)特性和預(yù)后，并且要尋找臨床治療有效的分子靶向。 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein，GRP78)，又名

2、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(the immu-noglobulin heavy chain binding protein，Bip)，是主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白，具有鈣離子粘合性和抗凋亡的特性。近年來研究表明GRP78在某些腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，對于腫瘤細(xì)胞的抗化療藥物的性質(zhì)及抗原表達(dá)有重要意義。一些研究表明，GRP78可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活，提高腫瘤細(xì)胞的抗藥耐藥性，以及加速惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。并且，GRP78還可以影響細(xì)胞凋亡途徑或其他信號途

3、徑中的組成因子，比如阻止PKC-ε/ERK/AP-1信號級聯(lián)；抑制caspase-7和Bax活化。在實體腫瘤的微環(huán)境下，GRP78的應(yīng)激產(chǎn)生可以對抗針對G1期和S期產(chǎn)生毒性的化學(xué)藥物。并且還可以減少腫瘤細(xì)胞的凋亡，并且通過影響凋亡效應(yīng)器的作用來阻斷化學(xué)藥物引起的細(xì)胞死亡。因此，GRP78可作為腫瘤生長和治療效果的一個生物標(biāo)記。近期的研究已經(jīng)證實，在一些癌細(xì)胞中，將GRP78作為分子靶向可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且可克服癌細(xì)胞的抗藥耐藥性。

4、 鈣網(wǎng)織蛋白(Calreticulin，CRT)也是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，具有一些獨特的功能，比如伴侶蛋白活性和調(diào)節(jié)Ca2+。研究發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)織蛋白可增加Ca2+通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的流動，卻降低了線粒體Ca2+濃度并降低了膜電位。因此，Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體兩個細(xì)胞器之間的周轉(zhuǎn)增加可能會損壞線粒體，這樣可以增強(qiáng)癌細(xì)胞對凋亡信號刺激的感受性。另外的一些研究也表明，鈣網(wǎng)織蛋白過表達(dá)的癌細(xì)胞對藥物和放射誘發(fā)的細(xì)胞凋亡更加的敏感，而鈣網(wǎng)織蛋白缺乏的癌細(xì)胞對紫

5、外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更具抵抗性。此外，鈣網(wǎng)織蛋白過表達(dá)還可以阻止Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、通過改變Ca2+穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)p53功能，以調(diào)整放射誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。 本實驗旨在研究GRP78和Calreticulin兩種蛋白在人骨肉瘤組織中是否有表達(dá)，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達(dá)的差異：化療前后表達(dá)的差異；遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移之間的差異。依此來推斷這兩種蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)與骨肉瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及化療對其表達(dá)的影響。 一、GRP78在人

6、骨肉瘤組織中表達(dá)及其意義的實驗研究 目的: 盡管目前許多研究已經(jīng)表明GRP78在許多惡性腫瘤中呈高表達(dá)，并與其惡性程度和侵襲力呈正相關(guān)，通過化療可以使其表達(dá)降低。但目前還沒有關(guān)于GRP78在人骨肉瘤組織中表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移、化療藥物之間關(guān)系的研究。本研究的目的為應(yīng)用不同的實驗方法來檢測GRP78在人骨肉瘤組織中的表達(dá)，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達(dá)的差異；化療前后表達(dá)的差異；遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移之間的差異，并依此來推斷這GRP78在骨肉

7、瘤組織中的表達(dá)與骨肉瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及化療對其表達(dá)的影響，以期能為骨肉瘤治療和預(yù)后評估提供實驗和理論依據(jù)。 方法: 1.免疫組織化學(xué)染色法檢測GRP78在不同部位組織中的表達(dá) 取骨肉瘤標(biāo)本30例，其中未轉(zhuǎn)移者5例，轉(zhuǎn)移者25例；術(shù)前化療者20例，術(shù)前未化療者10例。每例標(biāo)本同時取瘤體組織及正常組織作對照。取新鮮組織標(biāo)本在-20℃下做冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。 2.RT-PCR法檢測GRP78在不同部位

8、組織中的表達(dá) 取新鮮組織碾碎后抽提組織總RNA，然后用RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。將電泳圖移入圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測定。 3.Western-Blot法檢測GRP78在不同部位組織中的表達(dá) 取新鮮標(biāo)本碾碎提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行Western-Blot。將膠片掃描入圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測定。 結(jié)果: 1.免疫組織化學(xué)染色法檢測GRP78在不同部位組織中的表達(dá) 組織細(xì)胞胞漿被染為綠色

9、為陽性。GRP78主要存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上染色深時為全胞漿綠色，淺時為類泡樣胞漿綠染。GRP78的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織；腫瘤轉(zhuǎn)移組>未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組>術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。 2.RT-PCR法檢測GRP78在不同部位組織中的表達(dá) GR2P78在所有標(biāo)本中均有表達(dá)。GRP78的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織，腫瘤轉(zhuǎn)

10、移組>未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組>術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。 3.Westen-Blot法檢測GRP78在不同部位組織中的表達(dá) GRP78在所有標(biāo)本中都有表達(dá)。GRP78的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織>瘤體周圍正常組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組>未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組>術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。

11、 二、Calreticulin在人骨肉瘤組織中表達(dá)及其意義的實驗研究 目的: 盡管目前許多研究已經(jīng)表明Calreticulin在許多惡性腫瘤中表達(dá)，并與腫瘤生長和治療反應(yīng)有密切關(guān)系。但目前還沒有關(guān)于Calreticulin在人骨肉瘤組織中表達(dá)及其與轉(zhuǎn)移、化療藥物之間關(guān)系的研究。本研究的目的為應(yīng)用不同的實驗方法來檢測Calreticulin在人骨肉瘤組織中的表達(dá)，并比較骨肉瘤組織及正常組織表達(dá)的差異；化療前后表達(dá)的差異；遠(yuǎn)

12、隔轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移之間的差異，并依此來推斷Calreticulin在骨肉瘤組織中的表達(dá)與骨肉瘤生長、轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及化療對其表達(dá)的影響，以期能為骨肉瘤治療和預(yù)后評估提供實驗和理論依據(jù)。 方法: 1.免疫組織化學(xué)染色法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達(dá) 取骨肉瘤標(biāo)本30例，其中未轉(zhuǎn)移者5例，轉(zhuǎn)移者25例；術(shù)前化療者20例，術(shù)前未化療者10例。每例標(biāo)本同時取瘤體組織及正常組織作對照。取新鮮組織標(biāo)本在-20℃

13、下做冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色。 2.RT-PCR法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達(dá) 取新鮮組織碾碎后抽提組織總RNA，然后用RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR。將電泳圖移入圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測定。 3.Western-Blot法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達(dá) 取新鮮標(biāo)本碾碎提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行Western-Blot。將膠片掃描入圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度測定。

14、 結(jié)果: 1.免疫組織化學(xué)染色法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達(dá) 組織細(xì)胞胞漿被染為綠色為陽性。Calreticulin主要存在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔內(nèi)。染色為胞漿顆粒狀綠染。綠色強(qiáng)度代表表達(dá)量。GRP78和Calreticulin在所有標(biāo)本中都有表達(dá)。Calreticulin的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組<未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組<術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組

15、，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。 2.RT-PCR法檢測Calreticulin在不同部位組織中的表達(dá) Calreticulin在所有標(biāo)本中均有表達(dá)。Calreticulin的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組<未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組<術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。 3.Westen-Blot法檢測Calretic

16、ulin在不同部位組織中的表達(dá) Calreticulin在所有標(biāo)本中都有表達(dá)。Calreticulin的表達(dá)強(qiáng)度為瘤體組織<瘤體周圍正常組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組<未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組<術(shù)前化療組。瘤體周圍正常組織和瘤體組織，腫瘤轉(zhuǎn)移組和未轉(zhuǎn)移組，術(shù)前未化療組和術(shù)前化療組表達(dá)量有顯著差異。 結(jié)論: 本課題首次在人骨肉瘤組織中檢測到GRP78和Calreticulin的表達(dá)，運用免疫組織化學(xué)染色法、RT-PCR法和Western-

17、Blot法比較了骨肉瘤是否轉(zhuǎn)移和是否經(jīng)過化療后GRP78和Calreticulin的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78的表達(dá)骨肉瘤組織高于正常組織，發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移患者，未化療者高于化療者。 本研究表明，GRP78可刺激腫瘤增殖、存活、轉(zhuǎn)移，并且對化療藥物治療有相應(yīng)的反應(yīng)。而Calreticulin的過表達(dá)可使骨肉瘤患者對化療藥物的治療更加敏感。因此，GRP78和Calreticulin可作為骨肉瘤行為和治療反應(yīng)的分子靶向