表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路與卵巢癌細(xì)胞SKOV3-DDP耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、上皮性卵巢癌(epithelialovariancancer，EOC)在婦科惡性腫瘤中死亡率居于首位，由于缺乏早期診斷方法和預(yù)防篩查措施，約75％的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于晚期。目前卵巢癌的治療采用手術(shù)聯(lián)合化療的綜合治療手段，盡管治療手段的進(jìn)步使卵巢癌患者的治療取得了成效，但仍有60-80％的患者死于該病，最主要的原因就是術(shù)后高復(fù)發(fā)率及化療耐藥，因此，迫切需要一種新的治療手段用于卵巢癌的臨床治療。
　　 表皮生長(zhǎng)因子受體(Epiderm

2、algrowthfactorreceptor，EGFR)信號(hào)通路引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。有證據(jù)顯示，許多腫瘤中存在EGFR的過(guò)表達(dá)和異?；罨?，其中包括卵巢癌[1-2]，EGFR活化后通過(guò)激活PI3K/Akt及Ras/Raf/MEK/ERK等在內(nèi)的下游信號(hào)通路參與腫瘤的增殖、凋亡、血管生成、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程[3]，另外，研究表明EGFR信號(hào)通路可能介導(dǎo)化療耐藥的形成。吉非替尼(Iressa)是一種EGFR小分子酪氨酸激酶抑制劑，通過(guò)

3、與ATP競(jìng)爭(zhēng)受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合位點(diǎn)抑制EGFR的自身磷酸化過(guò)程。已有報(bào)道應(yīng)用吉非替尼阻斷EGFR信號(hào)通路的活化，可以增加化療藥物的敏感性。因此將EGFR信號(hào)通路作為藥物作用靶點(diǎn)為逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥提供了可能。
　　 目的:通過(guò)抑制EGFR信號(hào)通路的活化，觀察其對(duì)順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株SKOV3/DDP增殖、凋亡的影響，及逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的效果，初步探討EGFR信號(hào)通路的活化與順鉑耐藥的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1、Weste

4、rnblot檢測(cè)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞中EGFR、p-EGFR(活化的EGFR)蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)狀態(tài)。
　　 2、Westernblot檢測(cè)順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞中EGFR、p-EGFR蛋白表達(dá)的影響。
　　 3、MTT法檢測(cè)不同濃度的順鉑(0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響，獲得半數(shù)抑制濃度(IC50)，并計(jì)算耐藥指數(shù)。

5、r>　　 4、MTT法檢測(cè)不同濃度的吉非替尼(0.01、0.1、1、10、100μM)對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響。
　　 5、MTT法檢測(cè)1μM吉非替尼聯(lián)合不同濃度的順鉑(0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞增殖的影響，獲得聯(lián)用后順鉑的IC50，并計(jì)算耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。
　　 6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吉非替尼、順鉑、吉非替尼聯(lián)合順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響。
　

6、　 7、Westernblot檢測(cè)吉非替尼、順鉑、吉非替尼聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞EGFR、p-EGFR及下游信號(hào)通路Akt、p-Akt(活化的Akt)、ERK、p-ERK（活化的ERK）蛋白表達(dá)的影響。
　　 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊性檢驗(yàn)，三組以上采用方差分析，組間差異采用LSD法，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)

7、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)P＞0.05時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、Westernblot檢測(cè)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的EGFR、p-EGFR蛋白表達(dá)結(jié)果:
　　 SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞中均存在EGFR及p-EGFR蛋白的表達(dá)，EGFR蛋白在親本株與耐藥株的表達(dá)量無(wú)顯著差別(P＞0.05)，SKOV3/DDP細(xì)胞中p-EGFR蛋白的表達(dá)顯著高于SKOV3細(xì)胞的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義(P＜0.05)。
　　 2、Westernblot檢測(cè)順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的EGFR、p-EGFR蛋白表達(dá)結(jié)果:
　　 順鉑處理前后，SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著差別(P＞0.05)，順鉑處理后的SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞中p-EGFR蛋白的表達(dá)量相比于順鉑未處理組的細(xì)胞明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3、MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)S

9、KOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞增殖影響的結(jié)果:
　　 順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的IC50為3.74±0.03，SKOV3/DDP細(xì)胞的IC50為17.66±0.58，耐藥指數(shù)為4.72。
　　 4、MTT法檢測(cè)吉非替尼對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞增殖影響的結(jié)果:
　　 吉非替尼可以抑制SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種抑制作用呈劑量依賴(lài)性，當(dāng)濃度為1μM時(shí)，抑制作用明顯增加。同一濃度下吉非替尼對(duì)

10、SKOV3細(xì)胞的抑制率高于SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5、MTT法檢測(cè)吉非替尼聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞增殖影響的結(jié)果:
　　 與單獨(dú)應(yīng)用順鉑相比，1μM的吉非替尼聯(lián)合順鉑可增加對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制作用，聯(lián)合作用后順鉑的IC50為7.42±0.15，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為2.38。
　　 6、流式結(jié)果:
　　 在SKOV3/DDP細(xì)胞中，吉非替尼、順鉑

11、、吉非替尼+順鉑的凋亡率分別為(7.52±0.63)％、（8.13±0.91）％、(17.33±0.84)％，均高于對(duì)照組（未加藥物處理組）的凋亡率(0.28±0.12)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且聯(lián)合組的凋亡率均高于單一用藥組(P＜0.05)，但仍低于順鉑作用于SKOV3細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡率（23.03±1.23）％(P＜0.05)。
　　 7、Westernblot檢測(cè)不同處理組對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞EGFR、p-

12、EGFR、Akt、p-Akt、ERK、p-ERK蛋白表達(dá)的影響結(jié)果:
　　 與對(duì)照組相比，順鉑、吉非替尼，順鉑聯(lián)合吉非替尼處理SKOV3/DDP細(xì)胞，EGFR、Akt及ERK蛋白表達(dá)量無(wú)顯著差別(P＞0.05)。順鉑處理后，p-EGFR及p-Akt、p-ERK蛋白的表達(dá)量增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。吉非替尼處理后，EGFR及Akt、ERK的活性降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。吉非替尼與

13、順鉑聯(lián)合處理后，p-EGFR及p-Akt、p-ERK蛋白的表達(dá)量顯著減少，與單用順鉑組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SKOV3/DDP細(xì)胞中p-EGFR蛋白的表達(dá)量顯著高于SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)，提示EGFR信號(hào)通路的異常活化可能參與了卵巢癌化療耐藥的過(guò)程。
　　 2、順鉑可以誘導(dǎo)EGFR信號(hào)通路的活化，降低順鉑對(duì)卵巢癌的細(xì)胞毒作用，應(yīng)用EGFR酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼可以協(xié)同順