肺癌患者腫瘤區(qū)域引流淋巴結細胞體內外抗腫瘤作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究TDLN細胞體內外抗腫瘤作用，初步探討TDLN細胞的作用機理，改良TDLN細胞的培養(yǎng)方法，為腫瘤特異性生物治療提供新思路。 方法：1肺癌患者TDLN細胞懸液的制備。 2肺癌組織單細胞懸液的制備。 3肺癌細胞抗原制備。 4TDLN細胞的活化：將患者TDLN細胞懸液(1×106/ml)加入24孔板中(1ml/孔)，分為三組，分別加入不同的刺激物。第一組加入IL-2(175U/ml)；第二組加入IL-

2、2(175U/ml)+自身tAg(50μg/ml)；第三組加入IL-2(175U/ml)+GM-CSF(500U/ml)+IL-4(100U/ml)+自身tAg(50μg/ml)。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 5TDLN細胞的異倍體檢測。 6TDLN細胞的免疫表型分析：經過活化的TDLN細胞培養(yǎng)14天后加入FITC-anti-CD83、FITC-CD3/PE-CD56和FITC-CD4/PE-CD8單克隆抗體，室溫

3、孵育30min，PBS洗滌2次，用流式細胞儀分析。 7細胞因子檢測：調整TDLN細胞濃度至2×105/ml，加入24孔板中(1ml/孔)，分為三組，第一組加入IL-2(175U/ml)；第二組加入IL-2(175U/ml)+自身tAg(50μg/ml)；第三組加入IL-2(175U/ml)+GM-CSF(500U/ml)+IL-4(100U/ml)+自身tAg(50μg/ml)。37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液一次。分

4、別收集培養(yǎng)至第7、14、21天的培養(yǎng)上清。用ELISA法檢測IL-12p70、IFN-γ和TNF-α的含量。用Griess法檢測培養(yǎng)上清中的NO的含量。 8TDLN細胞的殺傷實驗：經不同刺激物活化的TDLN效應細胞培養(yǎng)14天后，調整細胞濃度至2×106/ml。利用乳酸脫氫酶法檢測其對自體肺癌細胞的殺傷情況。 9TDLN細胞的體內抗腫瘤作用檢測：采用皮下埋塊法建立荷瘤裸鼠模型，分別注射IL-2刺激的TDLN細胞、IL-2+

5、自身tAg刺激的TDLN細胞、IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞和單獨注射IL-2。計算各組裸鼠瘤體體積，繪制生長曲線。 10組織學檢查：收集各組裸鼠的腫瘤組織，用4％多聚甲醛固定后切片，進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察。 12應用流式細胞學技術檢測各組裸鼠腫瘤細胞的調亡情況以及凋亡基因相關蛋白的表達情況。 結果：1從1g腫瘤區(qū)域引流淋巴結組織中可以獲得約1×108個TDLN細胞，經14

6、天培養(yǎng)后細胞數目可以增加一倍。 2經流式細胞技術分析，培養(yǎng)后的TDLN細胞中無異倍體細胞存在。 3經IL-2，IL-2+自身tAg，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞中CD3陽性的細胞比率分別為：(81.83±5.56)％，(80.20±4.16)％，(83.20±3.34)％；CD56陽性的細胞比率分別為：(8.72±3.02)％，(9.19±2.73)％，(9.44±2.90)％；CD4陽

7、性的細胞比率分別為：(50.41±4.29)％，(47.67±2.42)％，(42.87±4.75)％；CD8陽性的細胞比率分別為：(31.39±5.02)％，(30.57±3.59)％，(39.44±2.57)％；CD83陽性的細胞比率分別為：(20.40±4.92)％，(24.50±4.33)％，(30.87±2.25)％。 4IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞與IL-2/IL-2+自身tAg刺激

8、組相比，分泌IL-12p70、IFN-γ和TNF-o的水平明顯增高，有顯著性差異(P＜0.01)。三個刺激組分泌的NO水平無顯著性差異(P＞0.05)。 5經IL-2，IL-2+自身tAg，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞對自身肺癌細胞的特異性殺傷率分別為：(41.67±6.28)％，(57.76±9.51)％，(70.78±6.06)％，三組間TDLN細胞的殺傷率有明顯差異(P＜0.05)。IL-

9、2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞與IL-2/IL-2+自身tAg刺激組相比，對肺癌細胞的特異性殺傷率明顯增高(P＜0.05)。 6荷瘤裸鼠經不同方法治療后腫瘤的生長情況與生理鹽水處理的對照組荷瘤裸鼠相比，從第二周開始單獨使用IL-2治療和不同刺激劑誘導TDLN細胞治療的荷瘤裸鼠可明顯抑制腫瘤的生長(P＜0.05)。從第三周開始，應用三種刺激劑誘導TDLN細胞的治療作用比單獨使用IL-2更加明顯(P＜0.0

10、1)；不同誘導劑之間的抑瘤作用也存在一定的差異(P＜0.05)，其中以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg誘導TDLN細胞的抑瘤效果最強。 7經不同方法治療后，腫瘤組織細胞的凋亡情況對荷瘤裸鼠進行不同方法的治療，如注射生理鹽水、注射IL-2、注射IL-2刺激TDLN細胞、注射IL-2+自身tAg刺激TDLN細胞、注射IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞等，治療后腫瘤組織細胞發(fā)生了不同程度的凋亡現

11、象，細胞的凋亡率分別為：(7.07±3.31)％、(12.41±1.19)％、(22.30±2.83)％、(23.62±1.90)％、(33.06±4.46)％。經統(tǒng)計學分析發(fā)現，生理鹽水處理組和注射IL-2組荷瘤裸鼠的腫瘤凋亡率之間無明顯差異(P＞0.05)，明顯低于三種刺激劑誘導的TDLN細胞治療組的腫瘤凋亡率(P＜0.01)。三種刺激劑誘導的TDLN細胞治療組中，以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞誘導

12、腫瘤組織的凋亡率最高(P＜0.01)。 8凋亡基因相關蛋白的表達情況對荷瘤裸鼠經不同方法治療，如注射生理鹽水、IL-2組、IL-2刺激TDLN細胞、注射IL-2+自身tAg刺激TDLN細胞以及注射IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞等方法治療后，腫瘤組織中細胞凋亡相關蛋白bcl-2、bax、survivin的表達量存在明顯差異(P＜0.01)。注射IL-2刺激的TDLN細胞組、IL-2+自身tAg刺激的

13、TDLN細胞組、IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞組的腫瘤組織較注射生理鹽水組和單獨注射IL-2組的腫瘤組織bax的表達明顯增高(P＜0.01)；bcl-2和survivin的表達水平明顯降低(P＜0.01)。其中以IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞組最明顯。各組腫瘤組織表達凋亡基因相關蛋白Fas和FasL的量無明顯差異(P＞0.05)。 結論：1TDLN細胞在體外和體內均

14、具有很強的抗腫瘤作用。 2經不同刺激物活化后的TDLN細胞，抗腫瘤作用有很大差異，其中經IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞的抗腫瘤作用最強。經進一步研究發(fā)現，IL-2+GM-CSF+IL-4+自身tAg刺激的TDLN細胞中含有的CD83陽性細胞數明顯高于IL-2刺激組和IL-2+自身tAg刺激組。由于CD83是成熟樹突狀細胞的表面標志，所以樹突狀細胞可能在TDLN效應細胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用中起到了十分關