S型氯代甘油醇對(duì)精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、氯代甘油醇(α-chlorohydrin，ACH)，化學(xué)名3-氯-1，2-丙二醇(3-mono-chloro-propane-1，2-diol，3-MCPD)，是一種重要化工原料，普通人群可通過(guò)食用受污染的食物及以表氯醇樹(shù)脂過(guò)濾的飲用水暴露ACH。ACH有R型(R)-α-chlorohydrin，RACH)和S型((S)-α-chlorohydrin，SACH)兩種異構(gòu)體。S型氯代甘油醇(SACH)被認(rèn)為是經(jīng)典的睪丸后毒物，短期低劑量經(jīng)

2、口染毒SACH可致多種雄性動(dòng)物可逆性的不育。為研究SACH影響精子受精過(guò)程中可能的作用機(jī)制，本研究圍繞SACH與大、小鼠/人精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化關(guān)系，深入分析SACH對(duì)精子獲能調(diào)控信號(hào)通路的影響。
　　 第一部分 S型氯代甘油醇對(duì)大鼠精子功能的影響
　　 本研究以改良的Biggers，Whitten，Whittingham培養(yǎng)液(BWW)，37℃，5％CO2為大鼠精子獲能孵育條件，觀察6 h獲能過(guò)程中自發(fā)性頂體反應(yīng)和蛋

3、白酪氨酸磷酸化變化及體外精卵融合狀況，以驗(yàn)證該孵育條件是否支持大鼠精子獲能。結(jié)果顯示，大鼠附睪尾精子在獲能孵育之初幾乎不發(fā)生頂體反應(yīng)，蛋白酪氨酸磷酸化也處于低水平。隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，精子自發(fā)性頂體反應(yīng)率逐漸增加，在獲能孵育6 h頂體反應(yīng)發(fā)生率接近60％；精子的蛋白酪氨酸磷酸化水平在4.5 h之后開(kāi)始增強(qiáng)，在6 h磷酸化較為充分。在該孵育條件下，大鼠精卵融合率平均達(dá)到59.1％。以上結(jié)果表明，該孵育條件可充分支持大鼠精子獲能。
　　

4、 為觀察SACH對(duì)大鼠精子功能影響，本研究在獲能條件下以10μM、25μM、50μM和100μM SACH染毒大鼠附睪尾精子6 h，結(jié)果顯示：25μM SACH就可抑制精子運(yùn)動(dòng)速率，包括VAP，VCL和VSL以及精子頭擺動(dòng)幅度；精子超活化也受到抑制，25μM、50μM和100μM劑量組精子VCL≥400μm/s的比例與對(duì)照相比均大幅下降(P<0.05)；自發(fā)性頂體反應(yīng)可被10μM和25μM SACH明顯抑制，而濃度繼續(xù)增加(≥50μM

5、)則與對(duì)照沒(méi)有顯著差別。SACH抑制大鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化的作用非常顯著，100μM SACH可使85 kDa條帶蛋白酪氨酸磷酸化水平下降近90％，52 kDa條帶下降70％。但100μM SACH對(duì)大鼠精卵融合無(wú)顯著影響，1.0 mM或10 mM SACH才可顯著降低二細(xì)胞發(fā)生率。故SACH可顯著抑制SD大鼠精子的運(yùn)動(dòng)速率、超活化以及蛋白酪氨酸磷酸化。
　　 第二部分 S型氯代甘油醇對(duì)大鼠精子獲能相關(guān)蛋白磷酸化的影響

6、　　 以cAMP/蛋白激酶A(PKA)介導(dǎo)的蛋白酪氨酸磷酸化是動(dòng)物精子獲能調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)途徑。PKA通過(guò)磷酸化目標(biāo)蛋白絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)殘基間接調(diào)控下游蛋白酪氨酸磷酸化。本研究結(jié)果顯示，大鼠附睪尾精子在獲能過(guò)程出現(xiàn)PKA底物磷酸化逐漸增強(qiáng)；在獲能末期，磷脂酰肌醇－3激酶(P13K)85 kDa/55 kDa亞基均被酪氨酸磷酸化。以SACH在獲能條件下染毒大鼠精子，結(jié)果顯示PKA底物磷酸化和P13K85 kDa/55 kD

7、a酪氨酸磷酸化可被50μM和100μM SACH顯著抑制，提示PKA和PI3K活性可能受抑制。PKA活性受cAMP調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)50μM和100μM SACH可減低大鼠精子cAMP水平，而加入cAMP類似物dbcAMP和磷酸二酯酶抑制劑IBMX可拮抗SACH對(duì)獲能相關(guān)蛋白磷酸化的抑制作用，提示SACH通過(guò)抑制cAMP而影響下游獲能相關(guān)磷酸化。SACH可抑制大鼠精子特異的3－磷酸甘油脫氫酶(GAPDS)活性，降低其ATP水平，而加入甘油

8、可保護(hù)精子GAPDS、ATP、蛋白酪氨酸磷酸化、PKA底物磷酸化和PI3K酪氨酸磷酸化不受SACH抑制，表明糖酵解抑制是SACH影響精子蛋白磷酸化的原因。然而，研究未發(fā)現(xiàn)大鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化被SACH抑制與其功能受損存在直接聯(lián)系。
　　 第三部分 S型氯代甘油醇對(duì)人和小鼠精子獲能相關(guān)蛋白酪氨酸磷酸化的影響
　　 為了解其他動(dòng)物精子在獲能過(guò)程中蛋白磷酸化變化規(guī)律，本研究將人和小鼠精子在相應(yīng)獲能獲能下孵育5h或2h，結(jié)果

9、發(fā)現(xiàn)，人和小鼠精子在獲能孵育條件下發(fā)生蛋白酪氨酸磷酸化，人精子的110 kDa和85 kDa條帶磷酸化最為顯著，而小鼠在83 kDa條帶最為顯著，且均可被SACH抑制。本研究證實(shí)，甘油可以保護(hù)人精子蛋白酪氨酸磷酸化不受SACH抑制，且人精子更傾向于利用糖酵解途徑產(chǎn)生的ATP磷酸化相關(guān)蛋白，據(jù)此推測(cè)，SACH可能通過(guò)與在大鼠相似途徑抑制人精子蛋白磷酸化。與大鼠不同，在本研究中，小鼠精子PKA底物磷酸化在獲能過(guò)程逐漸下降，但仍可被SACH抑

10、制。SACH可抑制小鼠GAPDS活性，同時(shí)可影響小鼠精子與卵子黏附能力。為探討精子體外獲能受精過(guò)程的生理生化改變是否能作為評(píng)價(jià)雄性生殖毒物的方法，本研究以3－溴丙酮酸(BrPA)和奧硝唑，氟化物和新型污染物碘乙酸(IAA)等糖酵解抑制劑在獲能條件下染毒人精子，結(jié)果表明這些化學(xué)物對(duì)人精子蛋白酪氨酸磷酸化有不同程度的抑制。提示某些環(huán)境化學(xué)物可影響精子功能的作用，外源化學(xué)物對(duì)體外精子的蛋白酪氨酸磷酸化影響有望作為雄性生殖毒物篩選測(cè)試的體外評(píng)價(jià)