SPINK1通過EGFR通路促進前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、最近有關西方國家前列腺癌的研究證實，SPINK1過表達為ETS基因融合陰性的前列腺癌病例中侵襲性較強的一種分子亞型，然而SPINK1對前列腺癌腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用的具體機制尚未明確。我們收集了224例前列腺癌病例，證實在中國前列腺癌患者中SPINK1過表達與不良預后具有顯著的相關性(P=0.025)，且與EGFR具有共同過表達的特征(P=0.003)。本研究中的體外實驗證實SPINK1可促進前列腺癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe

2、lial-mesenchymaltransition，EMT)，從而增強前列腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。進一步的研究證實SPINK1主要通過EGFR/MEK/ERK通路發(fā)揮促進EMT的作用，CTGF可能為該通路下游的關鍵作用分子。實驗結(jié)果為SPINK1在中國前列腺癌中作為診斷指標及治療靶點提供了更深入的實驗及理論依據(jù)。
　　第一部分SPINK1在前列腺癌組織中的表達、臨床病理學特征及與預后的關系
　　目的:
　　1.研究中

3、國前列腺癌組織中SPINK1過表達的頻度及其與患者不良預后的相關性。
　　2.探究在中國前列腺癌組織中SPINK1過表達與其他分子指標的相關性。
　　結(jié)果:
　　1.中國前列腺癌中SPINK1過表達的發(fā)生頻率為7.6％，與患者不良預后相關。
　　2.SPINK1過表達與TMPRSS2-ERG基因融合存在排他性。
　　3.EGFR過表達的發(fā)生率在SPINK1陽性的前列腺癌病例中比在SPINK1陰性的前列腺癌病

4、例中高。
　　4.SPINK1陽性病例中E-Cadherin表達相對較低，vimentin表達相對較高。
　　結(jié)論:
　　在中國前列腺癌病例中SPINK1過表達的發(fā)生頻率為7.6％，與西方國家接近。與關于SPINK1在西方國家的相關報道一致，SPINK1過表達與TMPRSS2-ERG基因融合呈現(xiàn)排他性存在，SPINK過表達與不良預后具有顯著相關性。另外，我們首次證實在前列腺癌組織中SPINK1與EGFR存在共過表達的趨

5、勢。SPINK1陽性病例中E-Cadherin表達相對較低，vimentin表達相對較高，暗示SPINK1可能與前列腺癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程有關。
　　第二部分SPINK1促進前列腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　目的:
　　1.明確SPINK1是否可誘導前列腺癌細胞由上皮細胞表型向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變。
　　2.探究SPINK1是否可引起前列腺癌細胞上皮指標及間質(zhì)指標蛋白表達量的改變。
　　3.驗證SPINK1對

6、前列腺癌細胞侵襲遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.rSPINK1持續(xù)刺激6天后，RWPE、LnCap及VCap細胞中均含有一定比例的細胞變?yōu)殚L梭形，細胞失去極性，細胞分布較松散。
　　2.westernblot及免疫熒光技術均證明rSPINK1可引起RWPE細胞中E-Cadherin表達量增多、vimentin表達量減少，而轉(zhuǎn)染SPINK1SiRNA則可引起22RV1細胞中E-Cadherin表達量上調(diào)、vimen

7、tin表達量下調(diào)。
　　3.細胞劃痕實驗及Transwell實驗證實rSPINK1可促進RWPE細胞遷移侵襲能力增強，SPINK1SiRNA可抑制22RV1細胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　我們首次證實SPINK1在體外可促進前列腺癌細胞發(fā)生EMT。
　　第三部分SPINK1促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究
　　目的:
　　1.明確SPINK1是否通過EGFR通路促進EMT及具體通過哪條下游通路促進EMT。<

8、br>　　2.明確SPINK1通過EGFR通路調(diào)控的促進EMT的下游關鍵作用分子。
　　結(jié)果:
　　1.rSPINK1作用于RWPE細胞，可使其p-EGFR、p-STAT3、p-Akt、p-ERK水平升高。轉(zhuǎn)染SPINK1SiRNA的22RV1細胞，相對于其對照組，EGFR、STAT3、Akt、ERK磷酸化水平均顯著降低。
　　2.AG1478和U0126可幾乎完全阻斷rSPINK1對EMT分子指標的調(diào)節(jié)作用。而LY2

9、94002和AG490只可較低程度地抑制rSPINK1對EMT分子指標的調(diào)節(jié)作用。
　　3.細胞劃痕實驗結(jié)果示AG1478、U0126、LY294002、AG490均可完全阻斷rSPINK對細胞遷移能力的提高作用。侵襲實驗結(jié)果示只有AG1478、U0126可阻斷rSPINK對細胞侵襲的促進作用。
　　4.rSPINK1處理RWPE細胞，SPINK1SiRNA轉(zhuǎn)染22RV1細胞，snail、slug、twist、β-caten

10、in、zeb1的mRNA表達量及核內(nèi)蛋白表達量均無明顯變化。
　　5.rSPINK1處理RWPE細胞，CTGF表達量升高;SPINK1SiRNA轉(zhuǎn)染22RV1細胞，CTGF表達量下降。
　　6.CTGFSiRNA轉(zhuǎn)染RWPE細胞可部分逆轉(zhuǎn)rSPINK1促進EMT的作用。
　　7.AG1478和U0126可阻斷rSPINK1對CTGF的上調(diào)作用，而LY294002和AG490無此作用。
　　結(jié)論:
　　1.S