金黃色葡萄球菌腸毒素B適配子的篩選及初步應(yīng)用.pdf

1、目的：以金黃色葡萄球菌腸毒素B為靶物質(zhì)篩選獲得的富集單鏈DNA文庫(kù)為起始文庫(kù)，從中篩選獲得能高親和力和高特異性結(jié)合金黃色葡萄球菌腸毒素B的單個(gè)DNA適配子，并利用適配子建立的夾心法檢測(cè)患者血清標(biāo)本中SEB的含量，輔助診斷金黃色葡萄球菌感染；同時(shí)研究適配子在大鼠體內(nèi)對(duì)SEB超抗原活性的抑制作用。
　　 方法：⑴將富集文庫(kù)的篩選產(chǎn)物分別進(jìn)行擴(kuò)增、純化、膠回收和TA克隆轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，LB液體增菌保存。挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，作為

2、菌種保存，抽提質(zhì)粒，利用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以羧基磁珠作為分離介質(zhì)獲得單個(gè)適配子。⑵分別利用地高辛、熒光素和生物素標(biāo)記的適配子直接測(cè)試法，對(duì)適配子的結(jié)合率和特異性等性質(zhì)進(jìn)行鑒定。⑶分別采用抗體一適配子夾心法和文庫(kù)一適配子夾心法，用于SEB的定量檢測(cè)；同時(shí)對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行比對(duì)。利用文庫(kù)一適配子夾心法檢測(cè)臨床患者血清中SEB的含量。⑷將大鼠隨機(jī)分成4組，分別進(jìn)行不同的干預(yù)和處理；隨后檢測(cè)各組大鼠血清中IL-4，IL-6，ALT，AS

3、T，肌酐和尿酸的含量，并對(duì)各組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：①篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆和增菌培養(yǎng)后，選擇其中40個(gè)克隆子進(jìn)行了檢測(cè)，共獲得了30個(gè)條帶位置正確的適配子，并從中篩選得到了一條結(jié)合力和特異性均較好的適配子。②文庫(kù)一適配子夾心法和抗體一適配子夾心法均可用于SEB的檢測(cè)，且兩種檢測(cè)方法的結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而健康對(duì)照組與細(xì)菌感染組血清標(biāo)本中SEB的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③適配子在大鼠體內(nèi)對(duì)SEB超抗原活性具有一定的抑制作用，可有效