DTA基因表達(dá)載體對人乳腺癌細(xì)胞的選擇性表達(dá)和殺傷作用.pdf

1、白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT) 是白喉棒狀桿菌產(chǎn)的細(xì)菌外毒素,使機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重中毒反應(yīng)。它是由535個(gè)氨基酸組成，分子量為58000的單鏈多肽，在胰蛋白酶的作用下,可降解為A(193個(gè)氨基酸)和B(342個(gè)氨基酸) 兩個(gè)片段。A 片段分子量為21000具有ADP依賴的核糖酰基化酶活性，B 片段由穿膜區(qū)和受體結(jié)合區(qū)組成,分子量為37000。A片段核糖體依賴的酶活性的發(fā)揮，必須在B 片段的受體結(jié)合區(qū)與敏感細(xì)胞表面的特異受體結(jié)

2、合，通過內(nèi)化攜帶A片段移位達(dá)到細(xì)胞漿才能完成。完整的毒素不顯毒性,這是因?yàn)榛钚渣c(diǎn)在催化區(qū)和穿膜區(qū)的交界處，活性點(diǎn)入口由18個(gè)殘基組成的襻CL2和穿膜區(qū)所遮蔽，EF-Ⅱ(Elongation factor-2，延長因子Ⅱ) 至活性點(diǎn)的通道被阻斷，所以完整的白喉毒素不顯毒性。當(dāng)A片段進(jìn)入胞漿才具有活性，A片段催化NAD+對EF-Ⅱ的單一氨基酸殘基發(fā)生磷酸腺苷核糖?；?Adenosinediphosphoribosylate，ADPR),因而

3、EF-Ⅱ取代NAD+中的尼克酰胺，結(jié)果形成無活性的ADPR-EF-Ⅱ，EF-Ⅱ使多肽鏈在核蛋白體上移位使氨基酸不斷接上，從而使肽鏈在核蛋白體上延伸。當(dāng)EF-Ⅱ失去活性，肽鏈不能延長,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻,引起細(xì)胞功能損傷或變性壞死。DF3／MUC1抗原是一種高分子量的黏蛋白樣糖蛋白，在約80％的人乳腺癌中存在過度表達(dá)。研究顯示人乳腺腫瘤中MUC1抗原在RNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)幾乎是乳腺正常組織和良性病變的三十倍。對于乳腺癌的基因治療，利用

4、白喉毒素A片段的特性，根據(jù)乳腺腫瘤細(xì)胞（DF3陽性）來構(gòu)建重組載體，探討其選擇性表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中達(dá)到靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的研究具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)研究新構(gòu)建的含人乳癌DF3/MUC1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的DTA重組表達(dá)載體PGL3-DF3-DTA對乳腺癌DF3陽性的腫瘤細(xì)胞的選擇性表達(dá)和殺傷作用。在實(shí)驗(yàn)中將乳腺癌的兩種細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231分別接種至不同組裸鼠背側(cè)皮下，7天后開始用重組的質(zhì)粒進(jìn)行活體內(nèi)瘤內(nèi)注射治療，腫