新生血管特異性結(jié)合肽GX1抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管生成的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【背景】
　　糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy，DR)是最為常見的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，為成人致盲四大原因之一，嚴(yán)重威脅人類健康，其病理改變主要以視網(wǎng)膜新生血管生成為主，且伴有滲出、出血等病變，最終導(dǎo)致眼結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重破壞，視網(wǎng)膜脫離，甚至造成失明。因此，抑制視網(wǎng)膜新生血管生成對(duì)治療糖尿病視網(wǎng)膜病變有重要意義。傳統(tǒng)的玻璃體切除術(shù)、全視網(wǎng)膜激光光凝等療法，風(fēng)險(xiǎn)大、費(fèi)用高、療效有限，治療后易復(fù)發(fā)，并有一定

2、的視功能損害。目前，腫瘤治療領(lǐng)域出現(xiàn)的分子靶向治療為糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管生成的治療提供了新思路，采用這種治療策略在提高抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管治療療效的同時(shí)，可降低藥物的毒副作用，而尋找視網(wǎng)膜新生血管特異表達(dá)的分子成為其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　最新研究報(bào)道，腫瘤血管所表達(dá)的某些特異性分子，如aminopetidases及整合素受體在糖尿病視網(wǎng)膜病變中也有表達(dá)，并可介導(dǎo)噬菌體靶向及內(nèi)化入內(nèi)皮細(xì)胞。靶向αⅤβ3/αⅤβ5的小肽RGD-

3、4C可通過選擇性激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而抑制氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管生成，說明視網(wǎng)膜新生血管與腫瘤血管有某些體內(nèi)所共同表達(dá)的分子，這些分子有望成為糖尿病視網(wǎng)膜病變抗新生血管生成的新靶點(diǎn)。
　　我們利用體內(nèi)噬菌體呈現(xiàn)肽技術(shù)得到的GX1，是一種與人胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的環(huán)九肽 CGNSNPKSC，已獲國家專利。體外實(shí)驗(yàn)顯示，GX1能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、與人胃癌細(xì)胞SGC7901共培養(yǎng)的HUVEC（Co-HUVEC）

4、的增殖、管狀結(jié)構(gòu)形成等，體內(nèi)抑制雞胚尿囊膜新生血管生成，GX1與rmhTNFα的融合蛋白GX1-rmhTNFα可明顯抑制荷胃癌小鼠腫瘤組織的生長，說明 GX1可能具有抗腫瘤血管生成的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，GX1能夠與氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管特異性結(jié)合，提示其受體可能在視網(wǎng)膜新生血管生成中發(fā)揮重要功能，是視網(wǎng)膜新生血管的特征性分子，因此有必要進(jìn)一步明確 GX1及其受體在視網(wǎng)膜新生血管生成中的功能，本研究就將圍繞以上問題展開。
　　【

5、目的】
　　1.驗(yàn)證GX1短肽與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合特異性。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)探討GX1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、微管形成、周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響，為體內(nèi)試驗(yàn)提供依據(jù)。
　　3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討GX1對(duì)高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管生成的干預(yù)效果，從而闡明GX1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管生成的生物學(xué)功能。
　　【方法】
　　1.利用化學(xué)合成的GX1短肽、對(duì)照肽（CNKSP

6、SGNC，Pep2）及與生物素結(jié)合的GX1（bio-GX1）、Pep2（bio-Pep2）采用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞熒光的方法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat retinal microvascular endothelial cells，rRMECs）有無GX1受體特異性表達(dá)，以鑒定GX1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向能力。
　　2.通過 MTT實(shí)驗(yàn)、管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)研究GX1對(duì)rRMECs增殖能力

7、、微管形成能力、遷移能力等生物學(xué)特性的影響。
　　3. GX1對(duì)rRMECs作用后，經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分析其細(xì)胞周期分布和凋亡情況，為GX1作用的機(jī)制研究提供參考。
　　4.構(gòu)建高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，通過視網(wǎng)膜組織切片計(jì)數(shù)GX1、Pep2及 PBS腹腔注射后視網(wǎng)膜突破內(nèi)界膜的內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目及視網(wǎng)膜鋪片，對(duì)高氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管生成的干預(yù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而闡明GX1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管生成的生物學(xué)功能。
　

8、　【結(jié)果】
　　1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)證實(shí)，與Pep2和PBS相比，GX1短肽可與rRMECs特異性結(jié)合，驗(yàn)證了GX1對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜新生血管的靶向結(jié)合能力。
　　2. MTT實(shí)驗(yàn)、管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GX1可以抑制rRMECs的增殖，且其抑制作用呈劑量依賴性；同時(shí) GX1可抑制 rRMECs的微管形成、遷移能力；此外，GX1可部分抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子165（VEGF165）誘導(dǎo)的

9、rRMECs的增殖、微管形成及遷移增加。
　　3.流式細(xì)胞學(xué)分析顯示，與Pep2相比，GX1可顯著誘導(dǎo)rRMECs的凋亡（凋亡率分別為5.33％和7.33%）（P<0.05）；而GX1對(duì)細(xì)胞周期分布則無明顯影響。
　　4.成功構(gòu)建了高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型，在眼球組織切片上計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)可以看出，與腹腔注射Pep2組、PBS組及未注射GX1組相比，腹腔注射GX1組細(xì)胞核數(shù)明顯降低。視網(wǎng)

10、膜鋪片中，可見腹腔注射 GX1組視網(wǎng)膜新生血管的密度和異常程度明顯輕于腹腔注射Pep2組、PBS組及未注射GX1組。正常對(duì)照組未見明顯異常。
　　【結(jié)論】
　　1.GX1短肽具有糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管靶向性，并能抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、微管形成及遷移，以及誘導(dǎo)其凋亡，在體外發(fā)揮抗糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管生成的作用。
　　2.GX1可抑制高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型中的視網(wǎng)膜新生血管形成，從而為臨