生防芽孢桿菌胞外蛋白酶的純化及其拮抗作用.pdf

1、芽孢桿菌(Bacillus spp．)是存在于土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)微生物種群，具有很強(qiáng)的抗逆能力和抑菌防病作用，其抗菌防病機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性等方面。其中芽孢桿菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶類(lèi)(如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1.3-葡聚糖酶等)是重要的拮抗物質(zhì)之一。有關(guān)該菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和β-1.3-葡聚糖酶(β-1.3-glucanase)在生防中的作用已有一些研究。在工業(yè)上，芽孢桿菌是生產(chǎn)蛋白

2、酶的主要菌株，國(guó)內(nèi)有關(guān)芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道很多，而未見(jiàn)顯示明顯生防活性的芽孢桿菌胞外蛋白酶及其拮抗作用的相關(guān)報(bào)道。 本文從作物根際土壤中篩選高產(chǎn)蛋白酶并對(duì)棉花枯萎病菌及多種植物病原真菌具有拮抗作用的生防芽孢桿菌，并對(duì)其產(chǎn)生的胞外蛋白酶在生防中的作用進(jìn)行了研究，具體結(jié)果如下： 1.從山東泰安、青島小麥和花生根際土壤中分離到的118株細(xì)菌中通過(guò)透明圈實(shí)驗(yàn)、平板抑菌實(shí)驗(yàn)得到1株高產(chǎn)蛋白酶并且對(duì)棉花枯萎病菌(Fusariumo

3、xysporum f.sp.vasinfectum)及多種植物病原真菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌T2。通過(guò)形態(tài)特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析，鑒定該菌為枯草芽孢桿菌(Bracillus subtilis)。 2.明膠原位電泳結(jié)果顯示：菌株T2在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)可產(chǎn)生多種蛋白酶。最佳產(chǎn)酶條件為37℃、60h。培養(yǎng)液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀(30％～50％)、DEAE Sepharose Fast Flow、SP Scp

4、harose Fast Flow離子交換層析、SephadexG-75分子篩層析分離純化到一種蛋白酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳銀染后呈單帶，分子量約為29.0 kDa。 3.以酪蛋白為底物測(cè)定了溫度和pH對(duì)蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明：酶作用的最適溫度為60℃，最適pH為8.0。在熱穩(wěn)定性方面，低于50℃時(shí)酶活性較穩(wěn)定，50℃保溫30 min，酶活性保持在80％以上。在pH穩(wěn)定性方面，以不同pH值4℃處理1h顯示，該蛋白酶在pH5.

5、0～7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。為進(jìn)一步鑒定蛋白酶的性質(zhì)，本研究測(cè)定了酶的底物特異性和金屬離子及修飾劑對(duì)酶活性的影響。結(jié)果表明：該蛋白酶對(duì)酪蛋白具有最高的活性，對(duì)偶氮酪蛋白具有較高的活性，但對(duì)于牛血清白蛋白和卵清蛋白則活性較低。Na+、K+、pb2+、EDTA對(duì)酶有激活作用，Ca2+、Ba2+、Al3+、Zn2+、Mn2+、Hg2+、SDS對(duì)酶有部分抑制作用，而PMSF可完全抑制酶活，因?yàn)镻MSF是蛋白酶絲氨酸殘基的特異性抑制劑，推測(cè)該酶是一種

6、絲氨酸蛋白酶。 4.菌株T2蛋白粗提液抑菌實(shí)驗(yàn)表明：經(jīng)硫酸銨沉淀后的蛋白粗提液Ⅰ及加熱(100℃，30min)后的蛋白粗提液Ⅱ均可抑制棉花枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)，但后者的抑制作用減弱，表明在參與拮抗作用的胞外蛋白中，除了耐熱的抗菌蛋白類(lèi)物質(zhì)，不耐熱的酶類(lèi)等物質(zhì)發(fā)揮了重要作用。進(jìn)一步研究純蛋白酶液對(duì)棉花枯萎病的拮抗作用發(fā)現(xiàn)，菌株T2所產(chǎn)生的胞外蛋白酶可使棉花枯萎病菌孢子萌發(fā)的芽管畸形、膨大、形成圓泡狀物，使棉花枯萎菌菌絲溶解并發(fā)生明顯