福氏志賀菌基因組分析及耐藥機(jī)理研究.pdf

1、志賀氏菌病又稱(chēng)細(xì)菌性痢疾，是一種具有高度傳染性和嚴(yán)重危害性的腸道傳染病，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康和生命安全，在我國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)菌株為福氏志賀菌2a型，其主要感染人群為5歲以下的兒童和免疫障礙的人群。世界衛(wèi)生組織推薦治療菌痢的首選藥物為環(huán)丙沙星，其次為頭抱曲松和匹美西林。本文采用臨床常用的環(huán)丙沙星、頭孢曲松和一種廣譜抗生素四環(huán)素分別誘導(dǎo)福氏志賀菌301株產(chǎn)生耐藥性，然后對(duì)菌株基因組測(cè)序，從而在基因組水平研究其耐藥機(jī)理。
　　1.根據(jù)Gene

2、Bank中發(fā)表的各志賀菌血清型特性基因ipaH(M32063)、gtrⅡ(AF021347)、gtrⅩ(L05001)、R002(AF250878)組成多重PCR體系，用于福氏志賀菌301株的驗(yàn)證，能夠在多種細(xì)菌中快速、靈敏、特異的檢測(cè)出福氏志賀菌301株，不僅為之后實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保證菌株不受污染奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)創(chuàng)造出了一種快速檢測(cè)分離志賀菌的有效方法。
　　2.利用一系列梯度濃度的環(huán)丙沙星、頭孢曲松、四環(huán)素對(duì)福氏志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株分別誘導(dǎo)

3、后其MIC分別為64μg/mL、64μg/mL、128μg/mL，均已達(dá)到耐藥水平。依據(jù)各抗生素誘導(dǎo)菌株MIC增長(zhǎng)曲線(xiàn)選定福氏志賀菌301株標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行de novo測(cè)序，環(huán)丙沙星、四環(huán)素誘導(dǎo)的5、7、10代和頭孢曲松誘導(dǎo)的5、9、10代進(jìn)行重測(cè)序。
　　3.de novo測(cè)序共產(chǎn)生732Mb數(shù)據(jù)，組裝后經(jīng)基因組組分分析得到4，832個(gè)基因，78個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，44個(gè)小衛(wèi)星序列，11個(gè)微衛(wèi)星序列，102個(gè)tRNA和16個(gè)rRNA。然

4、后采用GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、Tremble、CAZy、ARDB、VFDB、PHI、T3SS等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的4832個(gè)基因序列進(jìn)行基因名、基因功能注釋和分類(lèi)，針對(duì)各數(shù)據(jù)庫(kù)特征，綜合利用各數(shù)據(jù)庫(kù)的優(yōu)點(diǎn)完善實(shí)驗(yàn)研究。利用de novo測(cè)序數(shù)據(jù)與已公布的福氏志賀菌301株基因組(NC_004337)比對(duì)檢測(cè)到317個(gè)SNP位點(diǎn)，包括74個(gè)同義突變;237個(gè)非同義突變和6個(gè)無(wú)義突變。
　　4.重測(cè)序序列與d

5、e novo序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)，即metG基因位點(diǎn)284497在TC-2、CIP-2、CRO-3中由T<->G的突變;gyrB基因位點(diǎn)1953446在CIP-2中由C<->A的突變;gydA基因位點(diǎn)670796在CIP-7中由A<->C的突變;rob基因位點(diǎn)335049在CIP-10中由G<->A的突變;narX基因位點(diǎn)1072783在CRO-8中由A<->G的突變。以及間區(qū)位點(diǎn)1538933在CIP3、CRO3、TC3中由A<

6、->T;1538929在CIP5、CR04、TC5中由G<->A;1538924在CIP8、CRO8、TC5中由G<->C。
　　5.對(duì)共有的突變基因metG（甲硫氨酰tRNA合成酶）功能注釋發(fā)現(xiàn)，metG主要影響甲硫氨酸的活化與轉(zhuǎn)移，且影響其他氨基酸的活化，在KEGG途徑注釋發(fā)現(xiàn)metG最終影響蛋白質(zhì)的合成。間區(qū)突變會(huì)影響酞酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶ppiA的功能。研究表明metG和ppiA基因突變不僅影響蛋白質(zhì)的合成，而且還是一個(gè)潛在