靶向抑制DNA修復(fù)基因Artemis增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的研究.pdf

1、研究背景：
　　 放射治療是現(xiàn)代腫瘤治療的主要手段之一,但大多數(shù)惡性腫瘤存在不同程度的放射抗拒性,嚴(yán)重影響了放射治療的療效?？朔@種放射抵抗性對(duì)改善腫瘤放射治療效果具有重要臨床意義。腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性主要取決于修復(fù)DNA損傷的能力。腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞之間存在DNA修復(fù)機(jī)制的差異也提示DNA損傷修復(fù)蛋白是腫瘤放射增敏治療的優(yōu)秀靶點(diǎn)。從分子機(jī)制上來(lái)說(shuō),電離輻射(IR)對(duì)細(xì)胞的主要致死性損傷為DNA雙鏈斷裂(DSBs)。DSBs

2、不能修復(fù)或錯(cuò)誤修復(fù)會(huì)導(dǎo)致染色體缺失、變異最終發(fā)生細(xì)胞死亡。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞,DSBs主要通過(guò)非同源末端連接(NHEJ)途徑進(jìn)行修復(fù),并且伴隨著由ATM啟動(dòng)的多種信號(hào)通路反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯等,以便協(xié)助修復(fù)。NHEJ途徑至少涉及7個(gè)主要成員的協(xié)同作用,DNA-PKcs,KLJ70／KLJ80,Artemis,XRCC4,DNA連接酶Ⅳ,XLF。、NHEJ蛋白的任一成員的缺陷或失活均表現(xiàn)為DSBs修復(fù)缺陷而引起的對(duì)IR敏感性的增加。抑制NH

3、EJ修復(fù)途徑和ATM依賴(lài)的修復(fù)反應(yīng)來(lái)增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性已有研究但仍很滯后,需做不斷的研究和革新。Artemis是目前研究最熱門(mén)的NHEJ修復(fù)分子。它的突變或缺陷會(huì)導(dǎo)致人類(lèi)放射敏感性嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(RS-SCID)綜合癥,表現(xiàn)為V(D)J重組障礙而致免疫功能缺陷,以及對(duì)離子射線嚴(yán)重的敏感性。研究表明,IR誘導(dǎo)的DSBs損傷修復(fù)中,Artemis受DNA-PKcs的調(diào)節(jié)參與復(fù)雜染色體斷端的處理,受ATM的調(diào)節(jié)參與染色質(zhì)重構(gòu)和端粒維持

4、,細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控等方面的細(xì)胞修復(fù)反應(yīng)。因此,Artemis在IR誘導(dǎo)的DSBs的修復(fù)反應(yīng)中,不僅是效應(yīng)器也是信號(hào)傳遞分子,其在整合DNA損傷信號(hào)通路,細(xì)胞反應(yīng)和DNA修復(fù)方面具有獨(dú)特的關(guān)鍵性作用。Artemis在DSBs修復(fù)中的重要作用解釋了Artemis缺陷細(xì)胞對(duì)IR的高敏感性,同時(shí)也提示Artemis可以作為放射增敏的新靶點(diǎn)。然而,目前對(duì)于抑制Artemis在增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性方面所起的作用及相關(guān)機(jī)制尚無(wú)開(kāi)展,在本研究中,我

5、們對(duì)此進(jìn)行了探索,并且提出了Artemis作為腫瘤放射增敏治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值和臨床意義。
　　 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果：
　　 1、Artemis在人類(lèi)結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與其放射敏感性的相關(guān)性研究。
　　 研究Artemis在腫瘤內(nèi)的表達(dá)情況及與放射敏感性之間的相關(guān)性對(duì)于建立以Artemis為靶點(diǎn)的放射增敏的策略是非常必要的。我們以50例臨床獲取的人類(lèi)結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織樣本為研究對(duì)象,通過(guò)定量PCR的方法,評(píng)估了

6、Artemis在癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)了28％的結(jié)腸癌組織中Artemis是高表達(dá)的,然后又在多個(gè)腸癌細(xì)胞系,使用定量PCR及克隆生存實(shí)驗(yàn)等評(píng)估了Artemis表達(dá)水平及其對(duì)放射線的敏感性,發(fā)現(xiàn)了二者之間存在的相關(guān)性,建立了Artemis作為放射增敏靶點(diǎn)的必要性及潛在價(jià)值。
　　 2、慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向抑制Artemis表達(dá)增強(qiáng)腸癌細(xì)胞的放射敏感性及相關(guān)機(jī)制研究
　　 Artemis亞等位基因造成的Ar

7、temis的顯著低水平表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出類(lèi)似于Artemis缺陷細(xì)胞的高放射敏感性,這也提示靶向沉默Artemis可能可以增加對(duì)放射線的敏感性。因此,我們篩選了可以有效沉默Artemis的siRNA靶點(diǎn),并構(gòu)建入慢病毒載體,借此沉默了人結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO細(xì)胞的Artemis蛋白,然后通過(guò)克隆生存實(shí)驗(yàn)及MTT實(shí)驗(yàn)并結(jié)合裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了沉默Artemis的RKO細(xì)胞對(duì)IR以及其他DNA損傷劑的敏感性明顯的增加。使用γ H2AX焦點(diǎn)分析法檢

8、測(cè)了Artemis沉默RKO細(xì)胞的DSBs修復(fù)動(dòng)力學(xué)的改變,證明了其DNA損傷修復(fù)的損害發(fā)生在8小時(shí)之后的慢修復(fù)通路,表現(xiàn)了與Artemis缺陷細(xì)胞相似的表型。最后通過(guò)各種凋亡檢測(cè)方法及免疫印跡的方法證明沉默Artemis對(duì)RKO細(xì)胞在DNA損傷劑誘導(dǎo)下發(fā)生了更多的凋亡事件,其中涉及了p53／p21通路相關(guān)的凋亡信號(hào)通路。
　　 3、 Anemis顯性失活突變體對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射增敏作用及相關(guān)機(jī)制的研究。
　　 失活基因的

9、方法除了siRNA干擾以外,還有一種引入顯性失活突變體的方法。顯性失活突變的方法比siRNA更加特異,適用范圍更廣泛。Artemis的一些突變體形式具有顯性失活作用已有報(bào)道。基于對(duì)Artemis蛋白結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)的深刻理解的基礎(chǔ)之上,在本研究中,我們通過(guò)基因克隆的方法構(gòu)建了C末端缺失且無(wú)核酶活性的Artemis突變體并將其過(guò)表達(dá)在放射抗拒腫瘤細(xì)胞系HeLa中,使用克隆生存分析法及MTT法,證明了Artemis突變體可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DN

10、A損傷劑的敏感性,并使用γ H2AX焦點(diǎn)分析證明其對(duì)DNA修復(fù)的影響是類(lèi)似于Artemis缺陷細(xì)胞的,最后通過(guò)免疫共沉淀及磷酸化分析證明了Artemis突變體具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Artemis上游蛋白DNA-PKcs和ATM的能力而損害了內(nèi)源性Artemis的磷酸化過(guò)程,因而可能損害了Artemis相關(guān)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、首次研究了Artemis在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)情況,證明了Artemis表達(dá)在不

11、同的組織間存在明顯的異質(zhì)性,部分結(jié)直腸癌腫瘤組織內(nèi)Artemis的表達(dá)高于癌旁正常組織,而且腫瘤細(xì)胞內(nèi)高水平的Artemis表達(dá)與其放射抗拒存在一定的相關(guān)性,我們提出在Artemis高表達(dá)且放射線抗拒的結(jié)直腸癌,靶向抑制Artemis增強(qiáng)腫瘤對(duì)放射線的敏感性且利于降低周?chē)M織損傷的治療策略有重要臨床意義。
　　 2、構(gòu)建了具有高干擾效率Artemis慢病毒RNAi載體,在目的細(xì)胞沉默了Artemis蛋白,然后在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明

12、了靶向沉默Artemis蛋白可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)IR及DNA損傷劑CPT等的敏感性,其中涉及p53／p21相關(guān)凋亡通路的參與。這是國(guó)際上首次通過(guò)靶向抑制Artemis表達(dá)而調(diào)節(jié)了腫瘤放射敏感性的研究,它為臨床上治療放療抵抗或化療抵抗的結(jié)直腸癌提供改善治療效果的新策略。
　　 3、構(gòu)建了人Artemis蛋白的突變體質(zhì)粒載體,證明了過(guò)表達(dá)突變體Artemis可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)IR及DNA損傷劑Etoposide的敏感性,用顯性失活的方