胚胎干細胞來源的胰島樣細胞團的移植排斥反應及白藜蘆醇抗移植排斥作用的實驗觀察.pdf

1、[目的]
　　 觀察移植小鼠對胚胎干細胞來源的胰島樣細胞團的移植排斥反應，探討中藥成分白藜蘆醇(Resveratrol，Res)對胰島樣細胞團的移植排斥作用，以了解胚胎干細胞來源的組織、細胞的免疫原性以及機體對他們的移植排斥情況，探討白藜蘆醇是否具有抗移植排斥作用、是否適合作為胰島移植的抗排異藥物，以求找到一種高效低毒、適合作為抗器官移植、特別是胰島移植排斥的新藥，為胰島移植的臨床運用提供實驗依據。
　　 [方法]

2、>　　 1.小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)的擴增及向胰島素分泌細胞定向分化的體外誘導：
　　 1.1 ESC的擴增：將ESC接種于經絲裂霉素處理后的小鼠胚胎成纖維細胞(mouseembryonic fibroblast，MEF)飼養(yǎng)層上，在含白血病抑制因子(LIF)的ESC培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4天后，按1:4比例傳代擴增一次。。
　　 1.2擬胚體(embryoid bodies，EBs)

3、的形成：將培養(yǎng)3-4天的ESC消化后接種于細菌培養(yǎng)皿，在EBs培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4-5天，使ESC自發(fā)分化為EBs。
　　 1.3 nestin陽性細胞(nestin positive cells，NPCs)的形成：將培養(yǎng)4-5天的EB轉種于Ⅰ型膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，貼壁后更換為NPCs誘導培養(yǎng)基，連續(xù)誘導培養(yǎng)2-3天可形成NPCs。
　　 1.4胰島素分泌細胞(insulin-producing cells，IPCs)

4、的形成：NPC形成后，更換為IPC誘導培養(yǎng)基，至第4d，培養(yǎng)液中添加濃度為10mmol/L的葡萄糖，24h后更換為含葡萄糖20mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至IPC聚集為胰島樣細胞團(islet-like cell clusters，ICCs)。并用雙硫腙(DTZ)染色進行鑒定。
　　 2.移植動物準備：本實驗選取6～8周齡昆明小鼠作為移植受體。將實驗小鼠分為四個小組，每組3只。①CsA陽性對照組：按5mg/kg體重的劑量給予環(huán)孢

5、霉素-A(CsA)0.5mL，腹腔注射；②Res實驗組：按60mg/Kg體重的劑量給予白藜蘆醇(Res)0.5mL，腹腔注射；③CsA+Res實驗組：分別按5mg/kg體重的劑量給予環(huán)孢霉素-A(CsA)0.25mL和60mg/Kg體重的劑量給予白藜蘆醇(Res)0.25mL，腹腔注射；④陰性對照組：不給任何藥物處理，僅腹腔注射0.5mL磷酸鹽緩沖液(PBS)。以上四組實驗動物均于移植前3天開始每天腹腔注射一次，直至取材日終止給藥。

6、r>　　 3.ICCs移植及移植排斥反應情況的檢測：將待移植的ICCs用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記，以便了解移植后的ICCs在小鼠體內的存活增殖情況。按平均每只小鼠200個細胞團的量，經注射移植到小鼠頸背部皮下脂肪組織，做好標記。移植后4天、8天及16天分批取移植有ICCs的脂肪組織，將每組標本一部分制作成冰凍切片，利用DAPI標記，采用激光共聚焦顯微鏡觀察移植細胞的存活增殖情況；另一部分制作成普通病理切片后常規(guī)H

7、E染色，觀察宿主對移植的ICCs的免疫排斥情況；另一部分切片進行免疫組織化學染色，觀察免疫排斥情況及Th1(IL-2、IFN-γ)和Th2(IL-6、IL-10)類細胞因子的表達情況，以了解Res的抗移植排斥效果，分析抗移植排斥的機理。
　　 [結果]
　　 1.ESC接種于飼養(yǎng)層MEF，經過3-4天的增值，ESC在有LIF存在時可形成致密的圓形或橢圓形集落。每4天傳代一次。
　　 2.在去除分化抑制因素后，ES

8、C在懸浮狀態(tài)培養(yǎng)4-5天后可自發(fā)形成球形細胞團，即擬胚體EBs。EBs在NPCs誘導培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)3-4天，可形成上皮細胞樣的nestin染色陽性細胞(NPCs)。NPC在IPC誘導培養(yǎng)基中做定向誘導培養(yǎng)6天后可形成為胰島樣細胞團(ICCs)。細胞團DTZ染色呈陽性，被染為深棕紅色，說明細胞團中有胰島素分泌細胞(IPCs)。
　　 3.移植前將待移植的胰島樣細胞團(ICCs)用DAPI標記后經激光共聚焦顯微鏡觀察，可見一團團與

9、ICCs形態(tài)一致的藍色熒光，說明ICCs標記成功；移植后8天取材的標本制成冰凍切片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察仍可見成團的藍色熒光散在分布于脂肪團中，可判斷為經DAPI標記后的ICCs所發(fā)出的藍色熒光。
　　 4.HE染色及免疫組織化學方法半定量分析結果比較顯示：各組均有不同程度的炎癥細胞浸潤(中性粒細胞、淋巴細胞等)，說明胚胎干細胞來源的ICCs移植后存在明顯的免疫排斥反應。藥物處理組(CsA、Res、CsA+Res)炎癥細胞浸

10、潤程度隨時間的延長而降低。在大量炎癥細胞浸潤的脂肪組織中可見許多呈團塊狀生長的、類似胰島素分泌細胞(IPCs)的小圓形細胞。細胞團塊內似有新生血管生成。非藥物處理組(對照組)只見許多炎癥細胞浸潤，未見似胰島素分泌細胞(IPCs)的小圓形細胞。冰凍切片上夜未見DAPI標記細胞發(fā)出的藍色熒光。說明移植細胞已經完全被排斥消失。細胞因子免疫組化檢測發(fā)現，CsA組的IL-2、IFN-γ、IL-6及IL-10的陽性表達率分別為60.50％、74.5

11、0％、56.50％及11.50％，Res組分別為18.50％、31.50％、28.50％及21.50％，CsA+Res組分別為15.50％、23.50％、26.50％及45.00％。CsA組的IL-2、IFN-γ及IL-6的陽性表達率明顯高于Res組和CsA+Res組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CsA+Res組的IL-10的陽性表達率明顯高于CsA組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Res組與CsA組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P

12、=0.08)。
　　 [結論]
　　 1.本實驗繼續(xù)采用分階段誘導方法，胚胎干細胞經過連續(xù)培養(yǎng)誘導，可以在18天的時間內獲得具有胰島素分泌功能的胰島樣細胞團(ICCs)。
　　 2.通過移植前后在激光共聚焦顯微鏡都可以觀察到經DAPI標記的細胞團所發(fā)出的藍色熒光，說明實驗組移植8天后仍有IPC存活。
　　 3.白藜蘆醇相比與環(huán)孢霉素-A更能降低IL-2、IFN-γ及IL-6的表達。白藜蘆醇與環(huán)孢霉素-A聯