G蛋白偶聯(lián)受體激酶5在帕金森病模型中的表達及其在帕金森病中的作用研究.pdf

1、帕金森病是一種神經退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病。以震顫、僵直、姿勢平衡障礙和運動功能障礙為臨床特點，并且以黑質紋狀體多巴胺神經元消失以及殘存的黑質多巴胺細胞胞漿中出現(xiàn)路易小體（Lewybodies，LBs）小體為病理特點。GRKs（Gprotein-coupledreceptorkinases）是G蛋白偶聯(lián)受體激酶，主要的功能是對G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupledreceptor，GPCRs）進行磷酸化，從而介導

2、GPCR的脫敏反應。GPCR被磷酸化后，抑制樣蛋白（Betaarrestins）與其結合，使其與G蛋白脫偶聯(lián)并發(fā)生內吞，進而調控細胞內信號傳遞的級聯(lián)反應。而GRKs除了具有通過GPCR發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用外，最近發(fā)現(xiàn)GRKs同時存在有一些非受體底物，如tubulin，synucleins和核蛋白體P2蛋白等。最近ShigekiArawaka等人發(fā)現(xiàn)在路易小體中存在有GRKs家族的GRK5蛋白。而且通過實驗證實了GRK5與α-Sy

3、nuclein存在共定位，并有力地證明了GRK5可以對α-Synuclein的第129位絲氨酸進行磷酸化。我們通過建立過表達α-Synuclein的帕金森病細胞模型和動物模型，研究GRK5在帕金森病中的表達變化以及GRK5在帕金森病中的可能作用，為發(fā)現(xiàn)帕金森病的發(fā)病機制和探索更好的治療方法提供新的方向。
　　 本研究主要包括以下兩個部分的實驗內容：
　　 1帕金森病α-Synuclein轉基因小鼠和細胞模型中G蛋白偶聯(lián)受

4、體激酶5的表達以及亞細胞水平的GRK5蛋白表達變化：采用免疫印跡和實時熒光定量PCR技術對具有不同的人α-Synuclein（ha-syn）表達水平的帕金森病α-Synuclein轉基因模型小鼠以及3月齡、6月齡和9月齡人α-Synuclein野生型高表達組轉基因小鼠腦組織進行GRK5的RNA和蛋白水平檢測，與同窩陰性對照小鼠進行比較。同時在建立的α-Synuclein穩(wěn)定轉染細胞系中進行GRK5的表達水平檢測并采用免疫熒光技術觀察GR

5、K5蛋白的亞細胞水平表達變化。研究結果顯示，GRK5蛋白的表達水平隨著α-Synuclein的表達升高而升高，并且發(fā)現(xiàn)GRK5蛋白在過表達α-Synuclein的細胞以及轉基因小鼠的腦組織中的細胞核以及細胞漿內均表達增加。
　　 2G蛋白偶聯(lián)受體激酶5的胞漿內以及胞核內功能研究：應用免疫印跡技術、免疫組織化學技術、HDAC活性檢測技術、染色體免疫共沉淀技術以及shRNA干擾技術對α-Synuclein穩(wěn)定轉染細胞系和人α-Syn

6、uclein野生型高表達組轉基因小鼠腦組織增高的胞漿以及胞核內GRK5蛋白的功能進行研究。研究結果顯示，胞漿中的GRK5蛋白具有除磷酸化α-Synuclein129位絲氨酸以外的其他作用，胞核中的GRK5蛋白通過影響組蛋白去乙?；傅幕钚詫e12基因的轉錄和表達進行調控。
　　 綜上所述，帕金森病中GRK5的表達增加可能通過增加組蛋白去乙?；富钚砸种频蛲鱿嚓P基因bc12的轉錄和表達發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)對于充分理解GRK5的功能