肥大細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒樣顆粒的模式識(shí)別與應(yīng)答效應(yīng).pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth diseasevirus，F(xiàn)MDV)感染偶蹄動(dòng)物所引起的急性和高度接觸性傳染病，嚴(yán)重威脅全球畜牧業(yè)的發(fā)展與食品安全，目前尚無有效的防治措施。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)是一種無致病性的籠狀蛋白質(zhì)顆粒，其抗原主要被MHC-Ⅰ類分子提呈，但對(duì)固有免疫識(shí)別VLP的機(jī)制尚不清楚。肥大細(xì)胞是固有免疫的效應(yīng)細(xì)

2、胞，并在適應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮啟動(dòng)與調(diào)節(jié)作用，盡管近年來對(duì)肥大細(xì)胞在抗病毒感染中的作用研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)肥大細(xì)胞在抗FMDV感染中的作用仍不清楚。
　　本文首先構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HBcAg-VP1-VP4、pcDNA3.1(+)-HBcAg和pcDNA3.1(+)-VP1-VP4，然后將其通過脂質(zhì)體2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK-293T細(xì)胞中，使其分別表達(dá)VLP、HBcAg和VP1-VP4蛋白。免疫印跡檢測結(jié)

3、果顯示，VLP的分子量約為47 kDa，用透射電鏡觀察經(jīng)磷鎢酸負(fù)染的VLP，可見直徑約為30 nm的病毒樣顆粒結(jié)構(gòu)，表明VLP制備成功。
　　用VLP負(fù)載經(jīng)TLR2、TLR4、甘露糖受體(mannose receptor, MR)和清道夫受體(scavenger receptor，SR)抑制劑分別處理的小鼠腹腔肥大細(xì)胞(peritoneal mast cells,PMC)，以HBcAg和VP1-VP4蛋白分別負(fù)載上述PMC為對(duì)照，

4、并設(shè)空白PMC對(duì)照，分別在15min、30min、45 min和60 min收集上清液，用ELISA檢測PMC上清中β-氨基己糖苷酶(β-hexosami-nidase，β-Hex A)的含量變化，以反映PMC的脫顆粒情況。結(jié)果顯示:抑制TLR2和SR的PMC負(fù)載VLP的上清中β-Hex A含量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)。抑制TLR2和TLR4的PMC負(fù)載VP1-VP4的上清中β-HexA含量顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)。其余的

5、抑制受體的上清中β-Hex A含量與對(duì)照組相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　用重組FMDV VP1-VP4蛋白負(fù)載經(jīng)MR抑制劑處理的PMC，在24h收集PMC上清液，用蛋白芯片檢測PMC識(shí)別VP1-VP4后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。結(jié)果顯示，與PMC組相比，VP1-VP4組的PMC上清中的I-TAC、TARC和L-Selectin等12個(gè)蛋白質(zhì)分子為上調(diào)的差異表達(dá)。與VP1-VP4組相比，MR組的PMC上清中的IL-13、IFN-γ和MIP2等5

6、2個(gè)蛋白質(zhì)分子為上調(diào)的差異表達(dá)。
　　用VLP負(fù)載經(jīng)TLR2、TLR4、MR和SR抑制劑分別處理的PMC，以HBcAg和VP1-VP4蛋白負(fù)載上述PMC作為對(duì)照，分別在6h，12h，24h和48h收集PMC上清液，用ELISA檢測PMC上清中TNF-α、IL-6、IL-10含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制TLR2的PMC負(fù)載VLP，在1h的PMC上清中只有IL-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在6h的PMC上清中只有TNF-α和IL

7、-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在24h和48h的上清中只有TNF-α和IL-6含量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)。與之不同的是，抑制TLR2的PMC負(fù)載HBcAg和VP1-VP4后的24h，上清中IL-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，這提示VLP可以緩解由TLR2介導(dǎo)的VP1-VP4抑制PMC分泌IL-6的作用。
　　抑制TLR4的PMC負(fù)載VLP，在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)中只有48h的PMC上清中TNF-α含量極

8、顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)，這個(gè)變化與抑制TLR4的PMC負(fù)載VP1-VP4的上清中含量的變化趨勢是一致的，在1h的上清中只有IL-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在6h的PMC上清中只有IL-10含量顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在6h和24h的PMC上清中只有IL-10含量顯著低于對(duì)照組(p＜0.05)，在48h的上清中IL-6和IL-10含量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)。其中，抑制TLR4負(fù)載HBcAg的

9、上清中所檢測的三種細(xì)胞因子的含量變化趨勢與負(fù)載VLP的均相同。這表明，在48h之前，PMC識(shí)別VLP后所分泌的TNF-α不是由TLR4介導(dǎo)的。VLP被PMC識(shí)別后，在不同的時(shí)間點(diǎn)TLR4介導(dǎo)IL-6和IL-10的分泌亦或是抑制其分泌。
　　抑制MR的PMC負(fù)載VLP，在1h和6h的PMC上清中只有TNF-α和IL-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在24h的上清中只有IL-6含量極顯著的高于對(duì)照組(p＜0.001)，但是與

10、之不同的是在抑制MR負(fù)載VP1-VP4后的24h，上清中TNF-α和IL-6含量仍然極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在48h的上清中只有TNF-α和IL-10含量分別極顯著的低于和高于對(duì)照組(p＜0.001)。這表明，PMC識(shí)別VLP后對(duì)TNF-α和IL-6的分泌受到抑制，且在48h時(shí)IL-10的分泌也受到抑制，這種抑制是由MR所介導(dǎo)的，結(jié)果還說明了VLP可以將MR所介導(dǎo)的抑制PMC分泌TNF-α和IL-6的時(shí)間縮短。
　　抑

11、制SR的PMC負(fù)載VLP，在1h的PMC上清中只有TNF-α和IL-6含量極顯著高于對(duì)照組(p＜0.001)，在6h的PMC上清中IL-10含量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)，但是在24h的上清中TNF-α、IL-6和IL-10含量與對(duì)照組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在48h的上清中只有TNF-α和IL-6含量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.001)。這表明，在PMC識(shí)別VLP后的，可以引起PMC分泌TNF-α和IL-6。
　　以上結(jié)果表明