硝普鈉對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化和增殖是肝纖(維)化發(fā)生的關(guān)鍵,活化的HSCs分泌大量Ⅰ型前膠原(Trecollagen I)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors(of)matrix metalloproteinaseas,TIMP-1),活化的的HSCs的凋亡是肝纖維化得以逆轉(zhuǎn)的中心事件,故促進(jìn)活化HSCs的凋亡是抗纖維化治療研究的重要策略。
　　 核因子-

2、κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)作為一種廣泛存在體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,除能介導(dǎo)多種炎性介質(zhì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)外,它也參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,近年來(lái)研究認(rèn)為NF-κB通路在誘導(dǎo)HSCs凋亡,逆轉(zhuǎn)肝纖維化中有重要作用。
　　 一氧化氮(nitric oxide,NO)對(duì)基因表達(dá)調(diào)節(jié)作用是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的NO的一種新的生物學(xué)效應(yīng),文獻(xiàn)報(bào)道NO可調(diào)控NF-κB活性,并可通過(guò)線粒體膜通路誘導(dǎo)HSCs凋亡,而NO通過(guò)NF-KB通路誘

3、導(dǎo)HSC凋亡作用的機(jī)制尚未有人報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)通過(guò)NF-κB通路誘導(dǎo)HSC凋亡的作用,從而為臨床應(yīng)用該藥物抗肝纖維化治療提供了新的希望和理論基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下兩部分:
　　 第一部分硝普鈉對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制
　　 目的:研究硝普鈉對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用體外H

4、SCs培養(yǎng)技術(shù),采用MTT方法測(cè)定HSCs增殖;碘化丙啶(propidium iodide,PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)測(cè)定HSCs凋亡率,熒光顯微鏡及Hoechst33258熒光染色方法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變;Real-time PCR方法檢測(cè)Precollagen I、TIMP-1 mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下:①Control組,僅以含8％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞;②腫瘤壞死因子-α(

5、tumornecrosis factorα,TNF-α)組,濃度為100ng/ml;③SNP組,加入濃度分別為1、5、10、20mmol/L SNP;④SNP+TNF組,先加10mmol/L SNP后再加lOOng/ml的TNF-α。
　　 結(jié)果:①M(fèi)TT方法測(cè)定顯示不同濃度SNP對(duì)HSC-T6的增殖均具有明顯抑制作用,隨濃度增加,抑制作用增強(qiáng),1、5、10、20mmol/L SNP與對(duì)照組相比,分別為(0.89±0.23),(

6、0.50±0.13),(0.46±0.04),(0.36±0.09),(1.24±0.22),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②碘化丙啶(PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)顯示SNP組HSCs凋亡率較對(duì)照組HSCs凋亡率有顯著性差異(20.78±5.91％ vs3.25±1.26％,P＜0.05);SNP組HSCs凋亡率較TNF-a組有顯著性差異(20.78±5.91％ vs1.06±0.14％,P＜0.05);SNP+TNF-a組HSCs凋亡率

7、較TNF-a組有顯著性差異(15.36±5.97％ vs1.06±0.14％.P＜0.05),而對(duì)照組HSCs凋亡率較TNF-α組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。③Hoechst33258熒光染色顯示:對(duì)照組HSC細(xì)胞核呈彌散均勻的熒光;SNP組部分HSC的細(xì)胞核出現(xiàn)濃染致密的塊狀或顆粒狀熒光,提示細(xì)胞核濃縮、染色質(zhì)凝集、DNA片段化,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。④應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)SNP對(duì)大鼠HSC-T6的TIMP-1、Precol

8、lagenⅠmRNA表達(dá),可應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法進(jìn)行比較,以對(duì)照組(其mRNA的表達(dá)量為1)為標(biāo)準(zhǔn),1、5、10mmol/L SNP PrecollagenⅠ mRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別為(0.80±0.17,0.56±0.16,0.43±0.15)倍,均顯著低于對(duì)照組P=0.004);1、5、10mmol/L SNP TIMP-1 mRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別為(0.67±0.35,0.50±0.28,0.37±0

9、.27)倍,均顯著低于對(duì)照組(P=0.003)。即隨著SNP劑量不斷增加,PrecollagenⅠ,TIMP-1 mRNA表達(dá)隨之減少,提示SNP能抑制PrecollagenⅠ,TIMP-1 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論:SNP能抑制HSCs增殖并誘導(dǎo)其凋亡,減少PrecollagenⅠ,TIMP-1 mRNA表達(dá),從而減輕肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。
　　 第二部分硝普鈉誘導(dǎo)TNF-α刺激的肝星狀細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制
　　

10、 目的:探討NO供體SNP誘導(dǎo)大鼠HSC-T6凋亡與NF-κB通路的關(guān)系。
　　 方法:激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光標(biāo)記NF-κB P65的核移位;Real-time PCR方法檢測(cè)抗凋亡蛋白基因(growth arrest and DNAdamage-inducible protein,GADD45β)mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下:①Control組,僅以含8％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞;②腫瘤壞死因子-α(tumo

11、rnecrosis factorα,TNF-α)組,100ng/ml的TNF-α作用1h;③SNP組,10mmol/L SNP;④SNP+TNF組,先加10mmol/L SNP1h后再加100ng/ml的TNF-α刺激1h。
　　 結(jié)果:①激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,HSC-T6細(xì)胞株靜息狀態(tài)下NF-κB P65存在于細(xì)胞質(zhì),激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)果顯示TNF-α組激活HSC NF-κB P65,SNP組抑制TNF-α介導(dǎo)活化的

12、HSC NF-κB P65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。
　　 ②應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)SNP對(duì)大鼠HSC-T6的GADD451βmRNA表達(dá),采用相對(duì)定量法2-△△C(t)公式進(jìn)行比較,以對(duì)照組(其mRNA的表達(dá)量為1)為標(biāo)準(zhǔn),1、5、10mmol/L SNP GADD45βmRNA相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別為(0.43±0.20,0.36±0.18,0.26±0.07)倍,均顯著低于對(duì)照組P=0.001),即隨著SN