載脂蛋白A5重組蛋白和抗體的制備和臨床初步應(yīng)用.pdf

1、血脂異常與冠心病(coronary heart disease，CHD)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。載脂蛋白是行使脂類轉(zhuǎn)運(yùn)功能的血漿蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和含量異常將影響血脂代謝。血脂異常是冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，也是高血壓、肥胖和胰島素抵抗的易感因素。 載脂蛋白A5(apo1ipoproteinA5，ApoA5)是2001年P(guān)ennacchio等通過比較人、小鼠基因序列在人11q23染色體ApoAl／C3／A4簇附近發(fā)現(xiàn)的一種

2、新的載脂蛋白。動(dòng)物模型和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)的研究均表明ApoA5與血清甘油三酉旨(triglyceride，TG)水平呈負(fù)相關(guān)。此外，ApoA5還可以影響血高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)代謝。除了與血脂的代謝有關(guān)外，目前的研究顯示ApoA5還參與炎癥調(diào)節(jié)，這些都提示ApoA5可能是CHD的危險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子。目前，血清ApoA5濃度尚不清楚，ApoA5SNP是通

3、過影響血清ApoA5濃度還是改變ApoA5的功能來調(diào)節(jié)血TG的代謝也不清楚，血清ApoA5濃度與脂質(zhì)的關(guān)系及是否與CHD相關(guān)知之甚少。由于血清ApoA5的濃度極低，不能直接從血清中提取天然蛋白制備抗體。因此，本研究擬通過基因工程的方法表達(dá)重組ApoA5蛋白，制備抗體，進(jìn)而檢測(cè)血清ApoA5濃度具有重要的臨床意義。 目的 本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體表達(dá)重組ApoA5蛋白，并制備抗ApoA5抗體，檢測(cè)血清ApoA5的濃度和Apo

4、A5蛋白在人不同組織的分布，觀察ApoA5與血脂和CHD的關(guān)系。 方法 在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pOE30-ApoA5，表達(dá)重組ApoA5蛋白，通過鎳一硝基三乙酸(Ni-NTA)親和層析柱在變性條件下純化重組ApoA5蛋白，尿素梯度法透析復(fù)性。以該純化蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔和Balb／c小鼠，分別獲得抗ApoA5的多克隆抗體(polyclonal antibody，多抗)和單克隆抗體(monoclona

5、lantibody，單抗)。 用Western印跡法檢測(cè)人不同組織的裂解液(肝臟n=10，其它各種組織(包括心、脾、肺、小腸、血管)每種樣本n=5，血清n=40，不同血脂者各20)和免疫組化法檢測(cè)不同組織(其它各種組織(包括心、脾、肺、小腸、血管)n=5，肝臟n=lO)，觀察ApoA5的存在部位。進(jìn)一步配對(duì)了抗ApoA5單抗，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent

6、Assay，ELISA Sandwich)測(cè)定血清ApoA5在健康對(duì)照組(n=134)和CHD組(n=73)的濃度。 結(jié)果 1．獲得了2個(gè)重組ApoA5蛋白(分子量為40KDa和22KDa，分別與預(yù)期的全長蛋白和C端蛋白分子量一致)，產(chǎn)量較高(5mg／m1)，純度>90％和可溶性高(>50％)。 2．以純化的重組ApoA5蛋白為抗原免疫動(dòng)物，獲得了抗ApoA5的多抗和單抗，2種類型抗體可以檢測(cè)到重組ApoA5蛋白

7、，還可以檢測(cè)到血清天然ApoA5蛋白，與其它抗原無交叉反應(yīng)，說明抗體是特異性針對(duì)ApoA5，且對(duì)真核組織也有較高的親和力。 3．用抗Ap0A5的抗體檢測(cè)不同組織，發(fā)現(xiàn)僅肝臟有ADoA5蛋白存在，位于肝細(xì)胞胞漿；不同血脂者的血清中都有天然ADoA5蛋白存在。 4．CHD組血清ApoA5濃度為388.4±93.Ong／ml，顯著低于健康對(duì)照組 (571.5±89.0ng／ml，P<0.01)。在校正血脂、空腹血糖(FBS)

8、、年齡和體重指數(shù)(BMI)等因素后，這種關(guān)系仍然存在。血清ApoA5濃度在穩(wěn)定型心絞痛和急性冠脈綜合征兩組中沒有差別(382.8±79.8ng／ml vs 390.2±96.4ng／ml，P>O.05)。女性血清ApoA5濃度比男性更高(579.2±80.8ng／ml VS 489.2±77.2 ng／ml，P

9、7、-0.34、-0.24和-0.24；與向密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)呈正相關(guān)(總?cè)巳簉=O.39，男性r=O.27，女性r=O.49)，P值均O.05)?？?cè)巳褐蠥poA5濃度與血清TG呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但是沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(r=-0.11，P>0.05)。 結(jié)論 1．原核表