棉花體胚同步發(fā)生及相關基因表達和蛋白磷酸化分析.pdf

1、體細胞胚胎發(fā)生是體細胞向胚胎發(fā)生途徑轉變的發(fā)育再建過程，也是植物全能性預言的最好說明。體細胞胚發(fā)生現(xiàn)象被看作是開展生物學理論研究的良好模型。研究棉花體細胞胚發(fā)生對于闡明植物發(fā)育的分子機理，促進作物的遺傳工程改良，無論在基礎理論還是在實際應用價值上都具有極其重要的意義。以陸地棉品種Coker201為材料，對體細胞胚發(fā)生過程中的同步控制技術、組織細胞學、基因表達、蛋白質表達和磷酸化、酪蛋白激酶活性以及蛋白質雙向電泳技術等進行了研究。研究結果

2、如下： 1.棉花體細胞胚胎發(fā)生的頻率低，且體細胞胚的發(fā)育存在著不同步性，給體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育過程的生理學、生物化學和分子生物學的研究帶來許多困難。以陸地棉品種Coker201為材料，首先篩選了適合體細胞胚胎發(fā)育的培養(yǎng)基配方，然后以此培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，建立了一種簡單有效的棉花體細胞胚高頻率發(fā)生和同步發(fā)育的培養(yǎng)體系。經(jīng)過多次繼代獲得的胚性愈傷首先在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)2d使其分散，然后過30目篩去除大的顆粒，重新懸浮于同樣的液體培

3、養(yǎng)基中。懸浮培養(yǎng)14d后，過50目篩，將篩上的胚性愈傷重懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中，并用吸管吸取懸浮液，將其均勻地接種在表面墊有濾紙的同成分固體培養(yǎng)基(附加2.46μmolL-1IBA和0.70μmolL-1kinetin)上。培養(yǎng)21d后，用摯有濾紙的相同的固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。利用這種培養(yǎng)體系，獲得的體細胞胚數(shù)量分別是單純懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)(不墊濾紙)的16.5倍和4倍。其中，球形胚、魚雷形胚和子葉胚的同步發(fā)生率分別為70.2％、52.3％

4、和73.0％。 2.以陸地棉品種Coker201下胚軸為外植體誘導愈傷組織，并以介于30-50目篩之間的胚性愈傷細胞團為材料進行單個細胞團培養(yǎng)，采用石蠟切片法觀察棉花愈傷組織誘導和分化過程及體細胞胚發(fā)生和發(fā)育過程。結果顯示棉花胚性愈傷組織有下胚軸兩端發(fā)生、內發(fā)生、非胚性細胞轉化、外發(fā)生和腺體處發(fā)生5種形成途徑，其中兩端發(fā)生和內發(fā)生是主要的形成方式，都是由下胚軸形成層細胞直接分化產(chǎn)生；棉花體細胞胚存在單細胞起源，多為表面發(fā)生，少量

5、為內發(fā)生，并經(jīng)歷球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚4個過程，與合子胚形成過程相似。棉花體細胞胚發(fā)育過程中最關鍵的事件似乎是極性的建立、頂端分生組織的形成以及前形成層的分化和生長軸變化。球形胚時期表皮原層的分化標志著體細胞胚結構分化的開始。初始前形成層的形成是體細胞胚形態(tài)轉變的第一個信號。球形胚內部等徑細胞軸向延長，接著前形成層生長軸發(fā)生變化，這些是心形胚或橢圓形體胚中的重要事件。魚雷形胚基本分生組織中液泡的出現(xiàn)開始了組織分化的過程。三種主

6、要的胚性組織系統(tǒng)包括芽頂端分生組織，根頂端分生組織和原形成層束在魚雷形胚階段清晰可見。隨后魚雷形胚上層分化形成芽原基和兩個葉原基。子葉胚的維管組織從兩片子葉伸向胚根，呈V形或Y形。對一些停滯發(fā)育的球形胚和魚雷形胚的解剖檢查表明，極性建立可能是決定體細胞胚能否萌發(fā)的關鍵因素。 3.在體細胞胚胎發(fā)生和合子胚發(fā)育的過程中，無論是胚胎發(fā)生的啟動還是胚狀體的形態(tài)建成都受到多種因子的調控，體細胞胚發(fā)生是一個由多種基因參與的復雜時空調節(jié)的發(fā)育

7、途徑。本研究從基因表達水平上對體細胞胚胎發(fā)生過程中所涉及的基因轉錄、轉錄后與翻譯后修飾以及糖類、脂類及氨基酸與蛋白質的合成轉運與代謝等生化進程進行了一定的分析。在所研究的33個基因中，有25個來自一個棉花的體細胞胚胎發(fā)生的SSH文庫，這些基因在棉花胚性愈傷和各時期胚狀體中有差異表達，另外5個SERK基因和3個CKII基因來源于相關Genebank庫。根據(jù)qRT-PCR的實驗結果，按目的基因的表達最高峰所對應的體細胞胚胎發(fā)生階段可將這些基

8、因分為3類：(1)與體細胞胚起始發(fā)生與形態(tài)建成相關。供試的基因中幾乎所有涉及代謝與轉運的基因均在這一階段出現(xiàn)表達高峰，這與前人研究中體細胞胚發(fā)生過程中DNA含量明顯增加，RNA合成速率明顯提高，mRNA種類豐富，氨基酸含量升高，蛋白質合成活躍的特征是不謀而合的，高水平的脂質轉運蛋白更是成為體細胞胚發(fā)生的分子標記物質；后轉錄因子在體細胞胚的形成與發(fā)育階段的高表達預示著其生命過程的復雜性。(2)與體細胞胚發(fā)育與成熟相關。從供試的基因表達高峰

9、所對應的胚胎發(fā)育階段來看，體胚與合子胚的發(fā)育成熟過程中對后轉錄因子、CKII、腺嘌呤、氨基酸與類脂物質代謝相關的基因需求量是不一致的。體細胞胚胎發(fā)育與成熟要求較高水平的細胞壁相關蛋白基因、腺嘌呤與氨基酸代謝相關基因與CKII基因；以SERK為代表的翻譯后修飾基因在體細胞胚發(fā)育階段的高表達被認為是復雜的蛋白質相互作用的標志，證明了體細胞胚的發(fā)育和成熟與起始發(fā)生和形態(tài)建成一樣是相當復雜的。(3)與合子胚發(fā)育相關。合子胚的發(fā)育和成熟要求更高水

10、平的?；D移酶；除ERT和SCL轉錄因子是體細胞胚胎發(fā)育所特有的，其余轉錄因子的表達水平在兩種類型的胚胎發(fā)育過程中沒有明顯特異之處。這可能與轉錄因子的DNA結合域所能識別的順勢因子的差異有關。本研究結果首次證實了HMG轉錄因子和GRP蛋白在植物體細胞胚和合子胚發(fā)生發(fā)育中及CKII在植物體細胞胚發(fā)生發(fā)育中的重要作用。APRT編碼基因在體細胞胚發(fā)育過程中的活躍表達，意味著在高等植物胚胎發(fā)生或發(fā)育過程中存在核苷酸補救合成途徑。本研究還發(fā)現(xiàn)一個

11、編碼氧化還原酶的基因在胚性愈傷組織中表達極度活躍，可能是該階段的標記基因。 4.蛋白激酶和磷酸酶主要參與通過蛋白磷酸化和去磷酸化調節(jié)的幾個細胞事件。這些事件包括細胞生長、分化和細胞代謝。CKI和CKII參與了幾種底物的磷酸化。在棉花體細胞胚發(fā)生過程中研究了蛋白質的磷酸化和酪蛋白激酶活性。在測試的體細胞胚發(fā)生的5個階段(非胚性愈傷組織、胚性愈傷組織、球形胚、魚雷胚和子葉成熟胚)觀察到許多不同的多肽被磷酸化。外源ATP增強了體細胞胚

12、發(fā)生各階段的蛋白磷酸化作用。岡田酸和礬酸鹽在磷酸化反應中的使用增加了蛋白磷酸化水平，這暗示除酪氨酸磷酸酶外，在體細胞胚發(fā)生過程各階段還存在絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。實驗中采用CKII抑制劑和膠內激酶分析所得結果表明，體細胞胚中存在CKII。 5.棉花愈傷組織和體細胞胚中富含多糖、多酚化合物、脂質、色素和其他干擾物質，因而采用常規(guī)方法難以制備高質量的蛋白質樣品。對陸地棉品種Coker201的胚性培養(yǎng)物，通過添加PVPP研磨和丙酮、TC

13、A/丙酮、甲醇/醋酸銨等有機溶劑的系列洗滌，然后再進行酚抽提，蛋白質質量得到顯著改善，獲得的2-DE圖譜質量高、可分辯的蛋白質點數(shù)多。比較分析3種裂解液對蛋白質的溶解效果發(fā)現(xiàn)，在裂解液中混合采用7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲以及4％CHAPS是有效的。對3種考馬斯亮藍染色方法和4種銀染色方法分別進行比較分析，認為由Neuhoff法改進而來的Bluesilver法敏感性比其他考染方法好，穩(wěn)定性也好；銀染色靈敏度高于考馬斯亮藍染