移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠腦梗死后神經(jīng)再生及功能恢復(fù).pdf

1、目的:
　　 第三次全國(guó)死因調(diào)查結(jié)果顯示,腦血管病已成為我國(guó)城鄉(xiāng)居民首位死亡原因,占死亡總數(shù)的22.45％,是單病種致死、致殘率最高的疾病,已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。腦梗死在腦血管病中最為常見,除發(fā)病4.5 h內(nèi)及時(shí)溶栓治療外,腦梗死至今尚無切實(shí)有效的根治方法。
　　 上世紀(jì)末開始,干細(xì)胞研究迅速發(fā)展。在干細(xì)胞及其治療腦梗死的基礎(chǔ)和臨床前期研究方面成果眾多。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mes

2、enchymal stemcells,BMSCs)作為細(xì)胞治療的主要成員之一,具備取材方便、免疫原性低、很少涉及倫理、可自體移植等優(yōu)點(diǎn)。目前,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示,BMSCs對(duì)腦梗死有治療作用,能促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)；此外,臨床試驗(yàn)近年來日益增多,部分結(jié)果證實(shí)BMSCs治療腦梗死安全且有效,這些均給腦梗死的臨床治療帶來希望。然而,BMSCs治療腦梗死的確切機(jī)制至今尚未研究清楚。起初倍受關(guān)注的“細(xì)胞替代學(xué)說”遭到質(zhì)疑。目前,大多學(xué)者認(rèn)

3、為,BMSCs的治療作用可能與其分泌的各種因子有關(guān)。
　　 腦梗死能誘發(fā)自身內(nèi)源性神經(jīng)干/前體細(xì)胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)的增殖,這些增殖的細(xì)胞遷移到梗死灶周邊(ischemic boundaryzone,IBZ)并分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。但是,大部分增殖的內(nèi)源性NSPCs會(huì)在數(shù)天內(nèi)凋亡,對(duì)腦梗死后神經(jīng)功能的恢復(fù)作用有限。NSPCs的迅速凋亡可能與腦梗死后梗死周邊極度缺乏血運(yùn)和營(yíng)養(yǎng)

4、的惡劣微環(huán)境有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)就腦內(nèi)移植BMSCs促進(jìn)大鼠腦梗死后血管新生,改善梗死周邊微環(huán)境,從而激活內(nèi)源性神經(jīng)再生的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法:
　　 采集正常成人男性志愿者骨髓,分離、純化獲得人BMSCs(human BMSCs,hBMSCs),體外培養(yǎng)擴(kuò)增至第5代,進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定和染色體分析。線栓法建立雌性SD大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞2 h再灌注模型(middle cerebral artery occlusion,MCA

5、O),隨機(jī)分為2組:①hBMSCs移植組,在模型建立后3 d,腦內(nèi)立體定向移植hBMSCs5x105；②對(duì)照組,移植等體積生理鹽水10μ1。腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU),標(biāo)記增殖的內(nèi)源性NSPCs。(1)改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評(píng)分(modified neurological severity scores,mNSS)和粘貼物移除實(shí)驗(yàn)分別評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)情況；(2)伊紅.蘇木素染色計(jì)算大鼠相對(duì)腦梗

6、死體積；(3)18F—FDGmicro-PET分析大鼠移植hBMSCs前后腦梗死周邊代謝的變化；(4)BrdU和vWF熒光雙染標(biāo)記增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞,CD31標(biāo)記新生血管；(5)激光多普勒血流儀檢測(cè)腦梗死周邊腦血流變化；(6)BrdU、Nestin和musashi1免疫熒光染色標(biāo)記室管膜下區(qū)(subventricularzone,SVZ)和海馬齒狀回顆粒層下區(qū)(subgranularzone,SGZ)的NSPCs；(7)通過免疫熒光雙染

7、的方法研究NSPCs的遷移、分化和凋亡,BrdU+/DCX+細(xì)胞提示NSPCs向神經(jīng)元前體細(xì)胞分化,BrdU+/NeuN+細(xì)胞提示NSPCs向成熟神經(jīng)元分化,Brdu+/GFAP+細(xì)胞提示NSPCs向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化,BrdU+/TUNEL+細(xì)胞提示NSPCs凋亡；(8)western blot測(cè)定梗死側(cè)腦組織VEGF、nestin、musashi1、ki-67和DCX的表達(dá)量。(9)熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence insi

8、tu hybridization,FISH)追蹤移植入大鼠腦內(nèi)的hBMSCs。
　　 結(jié)果:
　　 1、MCAO模型后2 W開始,hBMSCs移植組和對(duì)照組比較,行為學(xué)恢復(fù)更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表現(xiàn)為mNSS評(píng)分下降以及粘貼物移除實(shí)驗(yàn)中大鼠去除粘貼物的時(shí)間縮短。
　　 2、MCAO模型后12 W,伊紅-蘇木素染色顯示右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域大腦皮質(zhì)和基底核外側(cè)梗死灶,hBMSCs移植組大鼠相對(duì)

9、梗死體積為27.6％±4.8％,對(duì)照組大鼠相對(duì)梗死體積為36.4％±6.2％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、MCAO模型后2 W,micro-PET結(jié)果顯示,hBMSCs移植組大鼠梗死側(cè)皮質(zhì)和紋狀體攝取18F-FDG增加,代謝缺損較對(duì)照組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、同對(duì)照組比較,hBMSCs移植組大鼠腦梗死周邊BrdU+/vWF+細(xì)胞和CD31陽性血管數(shù)量增多,梗死側(cè)大腦中動(dòng)脈供血

10、區(qū)域腦血流(CBF)在MCAO模型后2w(移植細(xì)胞后11 d)明顯升高,腦梗死周邊VEGF表達(dá)量增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5、同對(duì)照組比較,hBMSCs移植組SVZ區(qū)和SGZ區(qū)內(nèi)源性NSPCs增殖、向IBZ區(qū)遷移以及向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化均顯著增強(qiáng),而NSPCs凋亡減少,另外,腦梗死側(cè)nestin、musashi1、ki-67和DCX的表達(dá)量增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 6