水稻苗期白化致死基因OsPPR6的圖位克隆和功能分析.pdf

1、葉綠體是高等植物最關(guān)鍵的組成部分之一，因為它是唯一可以將太陽能吸收轉(zhuǎn)化為化學(xué)能供機(jī)體維持生命的細(xì)胞器。因此葉綠體的分化、發(fā)育和功能對于地球上的生命物質(zhì)來說是至關(guān)重要的。
　　超過95％的葉綠體蛋白都是由核基因組編碼，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)葉綠體內(nèi)的。在葉綠體中他們與質(zhì)體編碼的蛋白一起組裝形成有功能的光合代謝復(fù)合物，因此前質(zhì)體到葉綠體的分化是一個需要核-質(zhì)基因協(xié)作的精細(xì)調(diào)控過程。在整個質(zhì)體發(fā)育的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，任何一個相關(guān)基因的改變都有可能導(dǎo)致葉

2、綠體發(fā)育的異常，從而產(chǎn)生不同類型的葉色突變體。
　　在本研究中，我們鑒定并克隆了一個新的水稻PPR蛋白OsPPR6，該蛋白對于水稻葉片早期的葉綠體發(fā)育至關(guān)重要的作用。OsPPR6基因單堿基替換導(dǎo)致了苗期白化的葉片，同時伴隨著葉綠體發(fā)育的異常，葉綠素含量幾乎為零，水稻供能不足，導(dǎo)致死亡。OsPPR6是一個位于葉綠體內(nèi)的PPR蛋白，參與葉綠體基因ndhB的編輯和ycf3的剪接。本研究提出了OsPPR6在水稻葉綠體發(fā)育中重要的的功能，為

3、葉綠體的發(fā)育機(jī)制和PPR家族功能的多樣性提供了依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1) osppr6突變體與野生型相比主要表型上的差異:突變體出苗就白化，待自身能量消耗完，兩葉一心期（15天）就枯萎而死。3％蔗糖處理發(fā)現(xiàn)，葉尖轉(zhuǎn)黃，逐漸變綠，說明突變體是因為能量供應(yīng)不足而導(dǎo)致死亡的。葉綠素含量與葉片表型相對應(yīng);葉綠體觀察發(fā)現(xiàn):葉綠體中沒有典型的類囊體片層結(jié)構(gòu)，而是產(chǎn)生空泡和嗜鋨顆粒，葉綠體形態(tài)和結(jié)構(gòu)不正常，說明葉綠體發(fā)育不正常，無法形成

4、光合作用場所;編碼葉綠素合成相關(guān)基因都顯著下降，而與質(zhì)體發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)異常，依賴PEP編碼的與光合結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因下調(diào)，依賴NEP編碼的與RNA聚合酶相關(guān)基因急劇上升，Western blot分析進(jìn)一步證明了這一結(jié)果。這說明葉綠體發(fā)育停滯在第二時期。DAB和NBT染色發(fā)現(xiàn)突變體中ROS過量積累。
　　2)遺傳分析表明，osppr6屬于單基因隱性突變。通過圖位克隆鑒定到目的基因OsPPR6由于單堿基的替換產(chǎn)生了保守氨基酸變異;目標(biāo)

5、基因是一個PPR蛋白家族成員，在大部分高等植物都有具有且同源基因之間氨基酸序列相對保守，且與擬南芥中AtECB2同源，屬于PLS亞家族，含有14個PPR基序的DYW亞群蛋白;通過互補(bǔ)和RNAi干擾轉(zhuǎn)基因驗證確實是OsPPR6突變導(dǎo)致白化致死的表型。
　　3) OsPPR6功能分析:借鑒前人的研究基礎(chǔ)，通過直接測序和RT-PCR發(fā)現(xiàn)，突變體葉綠體基因ndhB的737位堿基處沒有被編輯，從而導(dǎo)致氨基酸改變;同時也發(fā)現(xiàn)突變體中，ycf3