豬鏈球菌2型revS基因缺失株構建及HYL蛋白與宿主互作的研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptocuccussuis，S.suis)是當前嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。根據(jù)莢膜多糖(capsularpolysaccharide，CPS)抗原成分不同，將豬鏈球菌分為35個血清型(1-34型和1/2型)。其中，豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)是最常見、也是毒力最強的血清型，同時也是一種重要的人獸共患病原菌。 豬鏈球菌2型revS基因是一種反應調控因子(res

2、ponseregulator)，在SS2致病過程中可能起著很重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)該基因能夠在轉錄水平上對SS2多種毒力因子進行調控，缺失該基因后多種毒力因子表達減弱。鑒于此，本研究構建了豬鏈球菌2型revS基因缺失菌株和質粒介導的互補菌株，并對缺失菌株和互補菌株的生物學特性進行了研究，進一步研究其所調控毒力因子的表達情況，為深入研究豬鏈球菌2型的的分子致病機理奠定前期基礎。 透明質酸酶(hyaluronidase，HYL)由豬鏈

3、球菌2型Hyl基因編碼，該酶為粘多糖分解酶，可水解組織基質中的透明質酸，增加組織的通透性。另外也有研究報道，HYL可以作為一種調控蛋白，通過降低血中的透明質酸酶的濃來誘導血管的增生。在SS2感染過程中，細菌分泌的透明質酸酶是否可以改變宿主細胞通透性，導致鏈球菌及其分泌的毒力因子更容易進入宿主細胞內(nèi)而發(fā)揮毒性作用有關目前還不清楚。因此，本研究利用酵母雙雜交技術，以透明質酸酶作為誘餌蛋白，從小鼠的腦細胞和人的肺細胞cDNA文庫中尋找HYL的

4、互作蛋白，旨在為進一步探索HYL在SS2致病中的作用提供理論依據(jù)。 鑒于以上研究背景，本研究主要開展了以下研究內(nèi)容： 1.豬鏈球菌2型revS基因缺失菌株和互補菌株的構建與鑒定通過PCR分別擴增了revS基因上下游同源臂p1和p2基因片段、開放閱讀框(ORF)和全長序列，利用溫度敏感型“自殺性”質粒pSET4s構建了質粒pSET4s-p1-p2，并將該重組質粒電轉化進入親本菌SS2野生菌株SC21中，通過抗生素和溫度雙重

5、標記篩選，獲得revS因缺失菌株，命名SC211。另外，將revS全長基因定向插入穿梭載體pAT18中，構建了穿梭質粒pAT18-revS，并將該質粒電轉入revS基因缺失菌株SC211，通過抗生素篩選，得到質粒介導的revS基因互補菌株，命名為SC212。通過PCR、Southernblotting進一步對基因缺失突變菌株和互補菌株進行了鑒定，證實構建正確。 2.豬鏈球菌2型revS基因缺失菌株和互補菌株的生物學特性研究通過細

6、菌傳代培養(yǎng)，對缺失突變菌株SC211和互補菌株SC212的遺傳穩(wěn)定性進行了分析，結果顯示缺失突變菌株和互補菌株能夠穩(wěn)定生長。比較了基因缺失突變菌株、互補菌株及野生菌株的生長特性，發(fā)現(xiàn)缺失菌株的生長速度明顯加快，互補菌株也比野毒菌株的生長快。溶血性試驗結果表明，基因缺失后SC211的溶血活性明顯降低，而互補菌株SC212的溶血活性雖然有所回復，比基因缺失菌株明顯提高，但是沒有達到野毒菌株的水平。利用Hep2細胞為模型，研究不同菌株對細胞黏

7、附特性，結果顯示，基因缺失后鏈球菌對Hep2細胞的黏附能力明顯下降，只有野毒菌株的29％；互補菌株雖然黏附能力比基因缺失菌株要高，但是沒有達到野毒菌株的水平，只有野毒菌株的79％。以CD1小鼠為模型比較了不同菌株的毒力，結果顯示基因缺失后鏈球菌毒力明顯下降，基因缺失菌株的LD50(7.78×107)是野毒菌株LD50(7.63×106)的10倍，而互補菌株的毒力有所增高，但是沒有達到野毒菌株的水平，其LD50(2.44×107)是野毒菌

8、株的3倍。 3.豬鏈球菌2型revS基因缺失菌株和互補菌株的毒力相關因子的相對定量分析利用定量PCR研究了SS2毒力相關因子體內(nèi)外表達情況。體外定量結果顯示：除了cps和gapdh外，基因缺失菌株其他的毒力相關因子(ef，fbps，hyl，sly，sod，mrp,gyrap,和rpob)的表達都要比野毒菌株低，其中ef，fops，hyl，sly和mrp約下降了50％-80％。而互補菌株在gyrap、rpob和gapdh的表達上和

9、野毒菌株沒有明顯差別，其他毒力因子(cps，ef，fbps，hyl，sod，sly和mrp)的表達都明顯增高，在一定程度上上調了0.5-1.5倍。 攻毒后不同時間SS2毒力相關因子的表達水平比較發(fā)現(xiàn)：攻毒48h后的組織中鏈球菌毒力相關因子的表達量要比攻毒24h和72h的高，但是差異不顯著。而攻毒后不同組織中的SS2毒力相關因子的表達水平比較發(fā)現(xiàn)：攻毒后組織中毒力相關因子的表達量都比體外的高，差異顯著(p<0.01％)。腦組織和肺

10、組織中鏈球菌毒力相關因子的表達水平比血中的高，但是差異不顯著。在體內(nèi)，不同菌株毒力相關因子的表達水平比較發(fā)現(xiàn)：在體內(nèi)cps的表達野毒菌株和基因缺失菌株之間沒有明顯差異，但互補菌株的cps表達量是野毒菌株和基因缺失菌株的1.2倍。在基因缺失菌株中，mrp，ef，sly，fops，sod，rpob，gyra和hyl的表達量分別比野毒菌株降低了41％，37％，29％，39％，33％，46％，36％和49％，而在互補菌株中這些毒力相關因子的表達

11、量比基因缺失菌株增高了1.5-2.5倍，而不同組織中gapdh的表達沒有差異。 4.豬鏈球菌2型revS基因缺失菌株和互補菌株的免疫原性的研究免疫保護性實驗結果表明：106cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能夠對豬鏈球菌2型野毒菌株的攻擊提供90％免疫保護，107cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能夠對豬鏈球菌2型野毒菌株的攻擊提供100％免疫保護力；105cfu的互補菌株免疫CD1小鼠后能夠對豬鏈球菌2型野毒菌株的攻擊提供

12、90％免疫保護力，106cfu的互補菌株免疫CD1小鼠后能夠對豬鏈球菌2型野毒菌株的攻擊提供100％免疫保護力。不同菌株免疫CD1小鼠后ELISA抗體水平測定結果顯示：revS基因缺失后，豬鏈球菌2型的免疫原性并沒有太大的變化，基因缺失菌株免疫后所誘導的cps抗體水平與野毒菌株差異不顯著，但互補菌株的cps抗體水平明顯高于野毒菌株和基因缺失菌株。 5.豬鏈球菌2型HYL蛋白與宿主互作蛋白的篩選通過PCR方法擴增SS2Hyl全長基

13、因，定向克隆到pSos載體中，構建bait載體(pSos-Hyl)。將pSos-Hyl分別與鼠腦和人肺cDNA文庫(pMyr-cDNA)共轉化cdc25H酵母細胞，篩選與HYL相互作用的陽性克隆。經(jīng)過篩選和重復驗證，并對所得到的Target載體插入片段進行測序，BLAST分析，從鼠的腦組織cDNA文庫中得到2個與HYL相互作用的陽性克隆，兩個基因分別與鋅指結構基序(widely-interspacedzincfingermotifsge

14、neofMusmusculus(NT-039649REGION:18685755.18718324)，WIZF)和血管生長因子抑制因子1(ribonuclease/angiogenininhibitor1geneofMusmusculus(NT-166306REGION：2098219.2104509)，AI1)基因的同源性為99％和100％；從人的肺組織cDNA文庫中得到2個與HYL相互作用的陽性克隆，兩個基因分別與γ內(nèi)收蛋白(Hom

15、osapiensadducin3(gamma)(NT030059.12)，ADD3)和裝配架離子轉運蛋白(Homosapienschromosome6genomiccontig，referenceassembly，iontransporterprotein(NT034880.3)，AITP)基因的同源性為99％和100％。 6.豬鏈球菌2型HYL蛋白與宿主互作蛋白的驗證與分析將Hyl克隆到pET-28c載體中，構建重組表達載體(

16、pET28c-Hyl)進行原核表達，同時將篩選得到的WIZF、AI1、ADD3和AITP基因分別進行真核細胞表達后，用免疫共沉淀試驗驗證了HYL與AI1、ADD3和AITP之間的相互作用，而HYL與WIZF的證實沒有發(fā)生相互作用。進一步并分析和預測了AI1、ADD3和AITP可能與SS2致病性的關系。血管上皮細胞生長抑制因子(AI1)主要是抑制血管上皮細胞的生長，從而導致血管的通透性的改變，利于細菌的擴散。而ADD3是一種內(nèi)收蛋白，也是