褪黑素對(duì)大鼠重癥急性胰腺炎腎臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:觀察重癥急性胰腺炎大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),腎臟組織Livin蛋白和Caspase-9表達(dá)的變化,以探討褪黑素對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)相關(guān)腎臟損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:雌性SD大鼠90只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)(12H、24H、48H組分別各10只),模型組(SAP組)(12H、24H、48H組分別各10只),褪黑素組(MT組)(12H、24H、48H組分別各10只)。大鼠術(shù)

2、前12H禁食,自由飲水。3％的戊巴比妥鈉按40mg/kg婦的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉。常規(guī)消毒,鋪巾,在無(wú)菌操作下做上腹正中切口3cm左右,打開(kāi)腹腔,找到胃十二指腸交界處,再向下尋找到胰膽管十二指腸開(kāi)口處。用絲線結(jié)扎(活結(jié))近肝門處胰膽管,用4.5號(hào)頭皮針于十二指腸乳頭附近經(jīng)十二指腸腸壁穿刺,逆行插入胰膽管,并在十二指腸乳頭處用手指捏住胰管末端。按1ml/kg將5％牛磺膽酸鈉逆行勻速推注至胰管中(0.2ml/min),使整個(gè)胰膽管均勻隆起。退

3、出針頭,即用手壓迫進(jìn)針處約3～5min,然后去除結(jié)扎線,關(guān)腹,并同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)觀察。正常對(duì)照組開(kāi)腹后翻動(dòng)腸壁即關(guān)腹。褪黑素組在術(shù)后10分鐘用褪黑素溶液于大鼠背部皮下注射3ml。褪黑素按照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)選取大劑量(50mg/kg)。MT先被無(wú)水乙醇溶解,再用生理鹽水稀釋,使乙醇的終濃度為1％。模型組大鼠采用同樣方法給予等量的1％乙醇溶液。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清淀粉酶,肌酐(Cr),尿素氮(BUN)；用硫代巴比妥法測(cè)定MDA含量,黃嘌呤氧化

4、酶法測(cè)定SOD活力；免疫組化法檢測(cè)腎組織Livin和Caspase-9的表達(dá)；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:1.胰腺的病理改變:正常對(duì)照組大鼠胰腺組織大體所見(jiàn)未見(jiàn)明顯病變。SAP造模組大鼠胰膽管逆行注入5％牛磺膽酸鈉后,胰管周圍胰腺組織顏色立即變紅,并逐漸擴(kuò)展、加深。SAP造模12H后再次剖腹發(fā)現(xiàn)胰腺顏色紫暗,充血水腫明顯,可見(jiàn)局部壞死及出血,腹水明顯,呈淡紅色。褪黑素組大鼠12H后剖腹見(jiàn)胰腺顏色

5、變暗,充血水腫,但較模型組程度輕,未見(jiàn)明顯壞死、出血,有少量腹水。SAP造模24H后,剖腹可見(jiàn)腹腔內(nèi)大量淡紅色腹水,胰腺與周圍臟器粘連嚴(yán)重,表面可見(jiàn)多處出血點(diǎn)及壞死灶。褪黑素24H干預(yù)組剖腹觀察,大鼠腹腔內(nèi)可見(jiàn)腹水,胰腺與周圍組織輕度粘連,胰腺水腫,色澤紫暗,胰腺及網(wǎng)膜組織多處皂化斑。SAP造模48H后,剖腹可見(jiàn)腹腔內(nèi)大量血性腹水,胰腺與周圍臟器粘連嚴(yán)重,表面可見(jiàn)多處出血點(diǎn)、壞死灶及皂化斑。褪黑素48H干預(yù)組剖腹觀察,大鼠腹腔內(nèi)可見(jiàn)腹水

6、,腸管淤脹,胰腺與周圍組織輕度粘連,胰腺水腫,色澤紫暗,胰腺及網(wǎng)膜組織多處皂化斑。光鏡下觀察:正常組胰腺組織結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。SAP模型12H組可見(jiàn)胰腺葉間隔、小葉間隙、腺泡間隔增寬及少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；褪黑素12H干預(yù)組胰腺小葉間隙增寬、少量炎細(xì)胞浸潤(rùn),較胰腺炎組程度輕。SAP模型24H組時(shí)胰腺損傷較顯著,胰腺腺泡腫脹、出血、小葉內(nèi)和小葉外周局灶或片狀壞死,間質(zhì)可見(jiàn)較大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失。褪黑素24H干預(yù)組胰腺間

7、質(zhì)疏松水腫,小葉小片狀壞死,間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn),小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰。SAP模型48H組時(shí)胰腺損傷已經(jīng)十分顯著,表現(xiàn)為胰腺腺泡極度腫脹、出血、小葉內(nèi)和小葉外周局灶或片狀壞死,間質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失。褪黑素48H干預(yù)組胰腺間質(zhì)疏松水腫,可見(jiàn)紅細(xì)胞滲出、小葉小片狀壞死,間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn),小葉結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰。2.腎臟組織病理改變:正常對(duì)照組大鼠腎臟組織大體所見(jiàn)未見(jiàn)明顯病變。SAP模型組12H時(shí)腎臟外觀輕度水腫,呈暗紫色；24H時(shí)

8、腎臟充血水腫加重,并可見(jiàn)少量出血點(diǎn)。48H時(shí)腎臟充血水腫嚴(yán)重,并可見(jiàn)大量出血點(diǎn)。褪黑素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理改變均較SAP組減輕。光鏡觀察結(jié)果:正常對(duì)照組未見(jiàn)異常。各時(shí)點(diǎn)腎皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)正常。SAP組12H時(shí)腎小球輕度腫脹,腎小管腫脹較為明顯,腎間質(zhì)見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；24H時(shí)腎小球、腎小管腫脹加重,腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)壞死,腎間質(zhì)炎細(xì)胞增多。48H時(shí)腎小球、腎小管腫脹嚴(yán)重,腎小球可見(jiàn)淤血,腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)壞死,腎間質(zhì)

9、大量炎細(xì)胞,可見(jiàn)管型。褪黑素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)光鏡下所見(jiàn)病理改變均較SAP組減輕。3.生化指標(biāo):SAP造模組各時(shí)間點(diǎn)的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量較正常組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著升高(P<0.01)；SAP造模組各時(shí)間點(diǎn)的SOD活性較正常組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低(P<0.01)。與SAP造模組比較,褪黑素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量顯著降低(P<0.05)；SOD活性顯著升高(P<0.01)。4.凋亡相關(guān)指標(biāo):SAP造

10、模組各時(shí)間點(diǎn)Livin蛋白陽(yáng)性率較正常組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Livin蛋白陽(yáng)性率降低(P<0.01),Caspase-9陽(yáng)性率較正常組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)升高(P<0.01)；與SAP造模組比較,褪黑素干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)Livin蛋白陽(yáng)性率升高(P<0.05),Caspase-9陽(yáng)性率降低(P<0.05)。5.相關(guān)性分析:5.1SOD、MDA與腎功能損害的相關(guān)性分析結(jié)果:SOD與血清Cr呈負(fù)相關(guān)(r=-0.916,P<0.01),MDA與血清Cr呈正相關(guān)(

11、r=0.807,P<0.05)。5.2SOD、MDA與凋亡的相關(guān)性分析:腎臟細(xì)胞凋亡率與SOD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827,P<0.01),與MDA呈正相關(guān)(r=0.607,P<0.05)。5.3SOD、MDA與凋亡相關(guān)蛋白Livin、Caspase-9的相關(guān)性分析:SOD與Caspase-9表達(dá)程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.382,P<0.05),MDA與Caspase-9表達(dá)程度呈正相關(guān)(r=0.356,P<0.05)；SOD與Livin表