病原誘導(dǎo)的小麥ERF、MYB轉(zhuǎn)錄因子基因TaPIEP1和TaPIMP1的分離、特性及功能分析.pdf

1、近年來(lái)，小麥紋枯病、赤霉病等病害對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)的危害日益嚴(yán)重。小麥紋枯病、赤霉病抗性遺傳基礎(chǔ)研究薄弱，常規(guī)育種徘徊不前，其抗病反應(yīng)機(jī)制亟待研究。 本文以在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起重要調(diào)控作用的ERF、MYB轉(zhuǎn)錄因子為研究切入點(diǎn)，采用2步法策略(首先鑒定受病原誘導(dǎo)的早期反應(yīng)基因，然后分析其功能)，對(duì)病原誘導(dǎo)的2個(gè)新的小麥ERF、MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因進(jìn)行了全長(zhǎng)序列分離和較系統(tǒng)的研究，旨在為揭示小麥抗紋枯病、赤霉病反應(yīng)機(jī)制，開(kāi)辟小麥抗紋枯病

2、、赤霉病育種新途徑奠定理論和材料基礎(chǔ)。 本論文取得以下結(jié)果： 1.分離到2個(gè)病原誘導(dǎo)的小麥ERF、MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因TaPIEP1和TaPIMP1的全長(zhǎng)序列。 (1)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技術(shù)，從小麥赤霉菌誘導(dǎo)的抗病小麥品系蘇麥3號(hào)中，分離到1個(gè)小麥ERF轉(zhuǎn)錄因子編碼基因TaPIEP1全長(zhǎng)cDNA序列。源于蘇麥3號(hào)和中國(guó)春的TaPIEP1基因組DNA序列和cDNA序列分析表明，該基因無(wú)內(nèi)含子

3、，編碼由280個(gè)氨基酸殘基組成的ERF轉(zhuǎn)錄因子TaPIEP1。TaPIEP1具有AP2/ERFDNA結(jié)合域、酸性轉(zhuǎn)錄激活域和核定位位點(diǎn)等ERF轉(zhuǎn)錄因子典型結(jié)構(gòu)特征。TaPIEP1與其它ERF蛋白的全長(zhǎng)序列一致性較低，與OsERF1的一致性最高，僅達(dá)36.46％，是植物ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)新成員，屬于該轉(zhuǎn)錄因子家族的B-3c亞群或Ⅸ亞群。 (2)采用同源克隆策略及RT-PCR和RACE技術(shù)，從小麥赤霉菌誘導(dǎo)的抗病小麥品種蘇麥3

4、號(hào)中，分離到1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因TaPIMP1全長(zhǎng)序列，編碼由323個(gè)氨基酸殘基組成的小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子TaPIMP1。序列分析表明，TaPIMP1基因中具有一個(gè)內(nèi)含子，長(zhǎng)度為260bp，位于該基因編碼區(qū)的第233個(gè)核苷酸(G)與第234個(gè)核苷酸(C)之間。序列比對(duì)分析表明，TaPIMP1是一個(gè)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子，與其它MYB蛋白的全長(zhǎng)序列一致性較低，即使與一致性最高的OsJAMYB，僅為43.69％，是植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族

5、的一個(gè)新成員。進(jìn)化樹(shù)分析表明：TaPIMP1與水稻OsJAMYB和擬南芥AtMYB108的關(guān)系比較密切，序列一致性分別為43.69％和40.11％，而與小麥中的其它MYB蛋白關(guān)系較遠(yuǎn)，序列一致性僅17.32％～28.48％。 2.明確了TaPIEP1基因的表達(dá)特性。Q-RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaPIEP1在小麥中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受小麥紋枯病菌、赤霉病菌和白粉病菌誘導(dǎo)，其中，在抗病小麥品種中的誘導(dǎo)表達(dá)比在感病小麥品種中的迅速、強(qiáng)烈，

6、而且對(duì)小麥紋枯病菌和赤霉病菌的響應(yīng)比對(duì)白粉病菌的響應(yīng)明顯迅速。推測(cè)TaPIEP1可能主要參與對(duì)小麥紋枯病菌和赤霉病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。TaPIEP1在小麥中的誘導(dǎo)表達(dá)也受到防衛(wèi)相關(guān)植物激素乙烯(ET)、甲基茉莉酸(MeJA)和水楊酸(SA)誘導(dǎo)，其中，對(duì)ET和MeJA的響應(yīng)比對(duì)SA的響應(yīng)迅速，而且證明ET處理可以加速和增強(qiáng)TaPIEP1對(duì)赤霉病菌侵染的響應(yīng)。推測(cè)TaPIEP1可能主要通過(guò)ET/JA途徑參與對(duì)紋枯病菌和赤霉病菌的早期防衛(wèi)反應(yīng)，也

7、通過(guò)SA途徑參與對(duì)白粉病菌的防衛(wèi)反應(yīng)。 3.初步明確了TaPIMP1基因的表達(dá)特性。半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaPIMP1基因在小麥中能夠被小麥紋枯病菌、赤霉病菌，以及ET和MeJA誘導(dǎo)，初步推測(cè)TaPIMP1通過(guò)ET/JA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與小麥對(duì)紋枯病和赤霉病的防御反應(yīng)。 4.通過(guò)分子、生化分析證明TaPIEP1是能定位在細(xì)胞核、與GCCbox結(jié)合的、激活型的小麥ERF轉(zhuǎn)錄因子。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，TaPIEP

8、1-GFP融合蛋白集中分布在細(xì)胞核中，而對(duì)照GFP在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布，證明了TaPIEP1具有核定位的特性；凝膠阻滯結(jié)果表明，TaPIEP1不與DREbox順式元件結(jié)合，僅與GCCbox順式元件特異性結(jié)合，且GCCGCC序列是GCCbox的核心序列；酵母單雜交結(jié)果證明，F(xiàn)aPIEP1能夠在酵母體內(nèi)與GCCbox結(jié)合，激活報(bào)告基因LacZ的表達(dá)。預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄激活域缺失后，TaPIEP1的轉(zhuǎn)錄激活活性降低大半，表明該預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄激活域確

9、實(shí)是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄激活域，但FaPIEP1中可能還存在另外一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。 5.初步明確了TaPIEP1和TaPIMP1基因的一些抗病功能。通過(guò)基因槍法將TaPIEP1轉(zhuǎn)入推廣小麥品種揚(yáng)麥12號(hào)中，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥T0、T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)和小麥紋枯病抗性鑒定。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荏w(揚(yáng)麥12號(hào)，病情指數(shù)為3-4級(jí))相比，轉(zhuǎn)TaPIEP1基因陽(yáng)性的小麥植株對(duì)紋枯病的抗性顯著提高(病情指數(shù)為0級(jí))，說(shuō)明轉(zhuǎn)TaPIEP1基因能