MEKK3在TNF-α刺激后惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-6作用中的初步研究.pdf

1、惡性腫瘤是危害人類健康和生命的頭號(hào)殺手，許多細(xì)胞因子與惡性腫瘤密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞自身分泌或接受致炎因子(TNF-a等)刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-6，與惡性腫瘤的發(fā)塵發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及化療抵抗作用等預(yù)后不良密切相關(guān)。在查閱大量文獻(xiàn)和原有工作的基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用RNA干涉(siRNA)、基因克隆、基因轉(zhuǎn)染、Western-blot、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、RT-PCR和ELISA技術(shù)，探討有絲分裂原激活的蛋白激酶MEKK3在TNF-

2、a刺激后的惡性腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的IL-6中的作用，旨在為闡明惡性腫瘤細(xì)胞中TNF-a介導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生的機(jī)制和發(fā)現(xiàn)可能的治療藥物作用的靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。肺癌是高度惡性的腫瘤，其死亡率占惡性腫瘤的第一位；乳腺癌是世界各地女性中最為常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性死亡的主要原因之一。因此，本課題選擇肺癌和乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究。
　　 第一部分首先應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接受TNF-a刺激后IL-6的

3、產(chǎn)生。結(jié)果表明：在接受TNF-a刺激后，A549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞均能產(chǎn)生較高水平的IL-6。在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用Western-blot和RT-PCR方法分別檢測(cè)了A549細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞接受TNF-a刺激后MEKK3的磷酸化及MEKK3基因表達(dá)的改變，以判斷其是否是TNF-a信號(hào)途徑的成分。Western-blot結(jié)果表明：A549細(xì)胞接受TNF-a刺激后10min，MEKK3即發(fā)生磷酸化，30min達(dá)高峰，2

4、h后恢復(fù)正常；MDA-MB-231細(xì)胞接受TNF-a刺激后30min發(fā)生磷酸化，1h達(dá)高峰，2h后亦恢復(fù)正常。RT-PCR結(jié)果顯示：與未刺激的樣本對(duì)比，兩種細(xì)胞接受TNF-a刺激后，MEKK3 mRNA表達(dá)均明顯增加。Western-blot結(jié)果和RT-PCR結(jié)果均表明：MEKK3可被TNF-a激活、MEKK3是TNF-a信號(hào)途徑的信號(hào)分子，其接受TNF-a刺激后磷酸化的出現(xiàn)與改變及其mRNA表達(dá)的改變相似于文獻(xiàn)報(bào)道的其他蛋白激酶因接受

5、細(xì)胞因子刺激而活化后的磷酸化和基因表達(dá)的改變。
　　 第二部分應(yīng)用Ambion公司siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)MEKK3基因4個(gè)不同部位siRNA靶點(diǎn)的模板DNA序列，在體外合成相應(yīng)的DNA片段后，以BamHI及HindⅢ酶切位點(diǎn)分別克隆入pSilencer4.1-CMV hygro載體，構(gòu)建成四個(gè)針對(duì)MEKK3基因的siRNA表達(dá)載體-pSilencer4.1-MEKK3siRNA，再以脂質(zhì)體(Lipofectamine2000

6、)分別將其轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，應(yīng)用Western-blot檢測(cè)MEKK3 siRNA表達(dá)載體對(duì)MEKK3表達(dá)的抑制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)MEKK3 siRNA表達(dá)載體對(duì)MEKK3的表達(dá)均有抑制作用，其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制作用最為顯著，抑制率達(dá)84％，因此選擇將其分別轉(zhuǎn)染入A549和MDA-MB-231細(xì)胞，潮霉素篩選后獲得的抗性細(xì)胞克隆株，經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定后，結(jié)果顯示MEKK3 siRNA2/A5

7、49和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定克隆株中MEKK3的表達(dá)均獲得了80％以上的抑制，保證了后續(xù)的研究。
　　 第三部分首先應(yīng)用RT-PCR，擴(kuò)增MEKK3基因的全長(zhǎng)cDNA序列，通過KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)克隆入pcDNA3.1/hygro(+)載體中，構(gòu)建pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染入A549和MDA-MB-231細(xì)胞中。Western-blot結(jié)果顯示MEKK3蛋

8、白在此兩種細(xì)胞中均表達(dá)良好。應(yīng)用潮霉素篩選獲得的兩種細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞克隆株，經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其MEKK3 mRNA的表達(dá)水平與空載體穩(wěn)定細(xì)胞克隆株相比，均有顯著增加(分別增加了195％和177％)。結(jié)果表明pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，且成功地獲得了MEKK3高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞克隆株，進(jìn)一步保證了后續(xù)的研究。
　　 第四部分分別應(yīng)用RT-PCR和ELISA檢測(cè)TNF-a刺激未轉(zhuǎn)染的

9、A549和MDA-MB-231細(xì)胞(野生株)、MEKK3低表達(dá)的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定細(xì)胞克隆株、將MEKK3基因重新轉(zhuǎn)染入MEKK3低表達(dá)的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231并經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證恢復(fù)了MEKK3表達(dá)的細(xì)胞、A549和MDA-MB-231siRNA陰性對(duì)照穩(wěn)定細(xì)胞克隆株、MEKK3高表達(dá)的穩(wěn)定克隆株及pcDNA

10、3.1空載體穩(wěn)定細(xì)胞克隆株中IL-6的表達(dá)或產(chǎn)生。結(jié)果表明：MEKK3低表達(dá)的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231穩(wěn)定細(xì)胞克隆株IL-6 mRNA的表達(dá)及IL-6的產(chǎn)生均明顯低于野生株或陰性對(duì)照克隆株，差異非常顯著(P均＜0.01)；此兩細(xì)胞株恢復(fù)MEKK3表達(dá)后，其IL-6mRNA的表達(dá)和IL-6的產(chǎn)生均獲得了大幅度的提高，其結(jié)果高于野生株或陰性對(duì)照克隆株，差異非常顯著(P均＜0.01)；

11、A549和MDA-MB-231 MEKK3高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞克隆株接受TNF-a刺激后，其IL-6的產(chǎn)生均明顯高于兩者的野生株或空載體對(duì)照株，差異非常顯著(P＜0.01)。
　　 初步結(jié)果提示：MEKK3是TNF-a介導(dǎo)的肺癌和乳腺癌細(xì)胞中IL-6產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成分，MEKK3與TNF-a介導(dǎo)的肺癌和乳腺癌細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生密切相關(guān)，并在TNF-a介導(dǎo)的肺癌和乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生IL-6中起重要的調(diào)控作用，其下游信號(hào)途徑有待進(jìn)