家蠶與白僵菌互作機(jī)制的研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是鱗翅目昆蟲的代表物種，是人類經(jīng)過長期馴化而得來的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，有著良好的科學(xué)研究基礎(chǔ)，是探索昆蟲免疫防御機(jī)制、病原互作機(jī)制的重要模式生物。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是研究和應(yīng)用最多的病原真菌之一，能夠引起家蠶等經(jīng)濟(jì)昆蟲白僵病的發(fā)生，給蠶桑產(chǎn)業(yè)等經(jīng)濟(jì)昆蟲產(chǎn)業(yè)帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失。與此同時(shí)，球孢白僵菌因其寄主范圍廣泛、致病性較強(qiáng)、適應(yīng)性較強(qiáng)、兼容性較強(qiáng)以及制備和應(yīng)用操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，

2、被認(rèn)為是最好的生物防治菌種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)林產(chǎn)業(yè)害蟲的防治過程。本研究以球孢白僵菌為病原，以家蠶為宿主昆蟲，分別從病原侵染機(jī)制、病原致病機(jī)制和昆蟲防御機(jī)制等三個(gè)方面闡釋了白僵菌與家蠶的互作機(jī)制，取得如下主要結(jié)果。
　　一、球孢白僵菌對(duì)家蠶的侵染機(jī)制
　　體壁感染是球孢白僵菌侵入寄主昆蟲的主要方式，胞外水解酶在體壁感染中起到重要作用。本文檢測了11株白僵菌對(duì)家蠶的侵染毒力、胞外蛋白酶和胞外幾丁質(zhì)酶酶活力及相關(guān)基因的表達(dá)水平，并通

3、過統(tǒng)計(jì)分析軟件分析了胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性與白僵菌對(duì)家蠶侵染毒力的關(guān)系；檢測了蛋白酶和幾丁質(zhì)酶抑制劑對(duì)侵染毒力的影響；應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了白僵菌昆蟲體壁降解蛋白酶(BbCDEP1)并測定了該酶對(duì)家蠶體壁的降解作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌株的孢外蛋白酶活力和Bbcdep1的表達(dá)水平與半數(shù)發(fā)病時(shí)間(MMT)和半數(shù)致死時(shí)間(LT50)均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，擬合方程符合阻滯生長方程(Logistic equation)模型，而蛋白酶抑制劑實(shí)驗(yàn)也

4、證明白僵菌胞外蛋白酶抑制之后明顯降低了侵染毒力；蠶皮凍干粉誘導(dǎo)之后，不同菌株的Bbcdep1表達(dá)水平顯著提高，但上調(diào)倍數(shù)差異顯著；蠶體實(shí)驗(yàn)表明，白僵菌侵染家蠶之后，Bbcdep1僅在侵染前期上調(diào)表達(dá)，與孢子萌發(fā)時(shí)間相符合；酵母系統(tǒng)表達(dá)的BbCDEP1蛋白能高效降解家蠶體壁組織，其降解能力相當(dāng)于50％的蛋白酶K的活性。
　　另外，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，白僵菌菌株之間幾丁質(zhì)酶活力的差異不顯著，而且胞外幾丁質(zhì)酶活性與毒力的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性也不顯

5、著；但是用抑制劑抑制幾丁質(zhì)酶活性后，白僵菌的毒力明顯下降；定量PCR結(jié)果表明兩種白僵菌幾丁質(zhì)酶基因(Bbchit1和Bbchit2)在蠶皮粉誘導(dǎo)下上調(diào)表達(dá)模式不同，Bbchit1在各菌株均上調(diào)表達(dá)，而Bbchit2僅在部分菌株中上調(diào)表達(dá)，但是在白僵菌侵染家蠶過程中，Bbchit1和Bbchit2在孢子萌發(fā)和體壁穿透過程中均上調(diào)表達(dá)，而且Bbchit2在白僵菌感染家蠶后期顯著上調(diào)表達(dá)，說明Bbchit2可能參與了后期的致死過程。
　

6、　以上結(jié)果說明，白僵菌胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶是白僵菌侵染家蠶的重要毒力因子，但是它們的表達(dá)模式差異顯著；Bbcdep1可以作為毒力改造的目標(biāo)基因，而BbCDEP1也可以用于生物蛋白酶制劑的開發(fā)和利用；白僵菌胞外幾丁質(zhì)酶不僅參與侵染過程，還參與后期的致病過程，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。
　　二、球孢白僵菌對(duì)家蠶的致病機(jī)制
　　病原真菌通過營養(yǎng)競爭、分泌真菌毒素和破壞氧化還原平衡而最終導(dǎo)致宿主昆蟲死亡。我們提取了白僵菌毒素并

7、檢測了毒素對(duì)家蠶幼蟲的存活率和BmN細(xì)胞的影響；用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測了白僵菌侵染家蠶之后家蠶糖代謝酶系和抗氧化酶系相關(guān)基因表達(dá)量的變化；此外，我們還檢測了白僵菌侵染家蠶之后總抗氧化能力、SOD、和CAT活性的變化以及添加外源抗氧化劑對(duì)白僵菌毒力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白僵菌毒素能夠顯著降低家蠶幼蟲的存活時(shí)間，而且能夠使家蠶細(xì)胞發(fā)生凝集作用并最終崩解死亡。白僵菌侵染家蠶之后，糖代謝酶系相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá)，說明白僵菌能夠影響家蠶糖代謝

8、水平，破壞家蠶能量代謝。此外，白僵菌侵染家蠶之后，總抗氧化活力、SOD和CAT酶活性顯著下降，抗氧化酶系相關(guān)基因表達(dá)水平在感染后期顯著降低，而添加外源SOD和CAT等抗氧化劑能顯著提高家蠶的存活時(shí)間，說明白僵菌侵染家蠶后會(huì)破壞家蠶體內(nèi)的抗氧化平衡。以上結(jié)果說明，白僵菌通過分泌毒素、破壞家蠶的能量代謝和抗氧化平衡最終導(dǎo)致家蠶死亡，但具體的作用機(jī)制還要進(jìn)一步探索。
　　三、家蠶對(duì)白僵菌感染的免疫防御機(jī)制
　　昆蟲的先天性免疫防御

9、體系是抵抗病原微生物入侵的重要屏障。不同的病原會(huì)激活不同的免疫信號(hào)通路和免疫效應(yīng)因子而引起不同的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量的方法檢測了家蠶感染白僵菌后Toll信號(hào)通路、Imd信號(hào)通路、Jak/STAT信號(hào)通路和黑化作用相關(guān)基因，以及抗菌肽(AMPs)等效應(yīng)因子的表達(dá)水平；通過RNAi的方法分析了Toll信號(hào)通路和Jak/STAT信號(hào)通路的信號(hào)傳遞機(jī)制；檢測了信號(hào)通路特異的抑制劑抑制信號(hào)傳遞后對(duì)家蠶幼蟲存活率和血淋巴抗真菌活性的影響；用

10、原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了家蠶抗菌肽，并測定了其對(duì)白僵菌的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白僵菌侵染家蠶之后，能夠激活Toll信號(hào)通路、Imd信號(hào)通路、Jak/STAT信號(hào)通路和黑化作用，導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)因子表達(dá)水平的改變，但是各信號(hào)因子在白僵菌感染家蠶的不同時(shí)期表達(dá)水平差異顯著。BmβGRP RNAi干擾實(shí)驗(yàn)表明，家蠶中可能存在兩條Toll信號(hào)子通路：BmβGRP1-Bmtoll3–Bmtoll6–Bmtoll9-Bmspaetzle–Bmgloveri

11、n2和BmβGRP2or BmβGRP3–Bmtoll7-Bmlysozyme，它們在抗白僵菌侵染過程中可能起到重要作用。家蠶感染白僵菌后，BmPGRP-Lc、Bmdredd、Bmfadd、Bmtak1和Bmrelish1在不同的感染時(shí)期顯著上調(diào)表達(dá)，而Bmrelish2卻顯著下調(diào)表達(dá)，說明白僵菌入侵能夠激活家蠶的Imd信號(hào)通路，但可能主要通過Bmrelish1調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。家蠶感染白僵菌后，Bmctl5、Bmhop、Bmst

12、at均顯著上調(diào)表達(dá)，已知的Jak/STAT信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子 Bmsocs2、Bmsocs6和 Bmken則顯著下調(diào)表達(dá)，而另一個(gè)調(diào)節(jié)基因——Bmdrk則顯著上調(diào)表達(dá)，說明白僵菌侵染家蠶也能激活Jak/STAT信號(hào)通路；不同病原感染實(shí)驗(yàn)也表明，Jak/STAT信號(hào)通路只能被白僵菌所激活，而不能被LPS和BmCPV激活；此外，Bmctl5 RNAi干擾實(shí)驗(yàn)證明BmCTL5可能是Jak/STAT信號(hào)通路的重要模式識(shí)別受體。家蠶感染白僵菌后，

13、10種Bmserpin表達(dá)模式差異顯著，Bmserpin1、Bmserpin5、Bmserpin7、Bmserpin8和Bmserpin10在白僵菌感染的不同時(shí)期下調(diào)表達(dá)，預(yù)示它們可能參與到絲氨酸級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控，激活黑化作用等免疫反應(yīng)；Bmserpin2、Bmserpin3、Bmserpin4、Bmserpin6和Bmserpin9在整個(gè)感染過程中上調(diào)表達(dá)，我們推測它們可能通過抑制白僵菌絲氨酸蛋白酶——BbCDEP的活性，來提高家蠶的抗

14、真菌活力。另外，酚氧化酶活化級(jí)聯(lián)反相關(guān)基因在白僵菌侵染家蠶的整個(gè)過程中都顯著上調(diào)表達(dá)，說明白僵菌侵染家蠶會(huì)引發(fā)家蠶強(qiáng)烈的黑化反應(yīng)，也進(jìn)一步說明了黑化作用在昆蟲抗真菌免疫中起到重要作用?？咕氖抢ハx先天性免疫反應(yīng)的直接效應(yīng)因子。家蠶感染家蠶感染白僵菌后Bmmoricin1、Bmdefencin、Bmgloverin2、Bmlysozyme、Bmcecropin A、Bmcecropin B、Bmattacin、Bmlebocin1均顯著上

15、調(diào)表達(dá)，而抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明，只有BmCecropin A、BmCecropin B和BmAttacin三種抗菌肽對(duì)白僵菌有明顯的抑制作用，推測其它抗菌肽的上調(diào)表達(dá)可能是由于白僵菌主動(dòng)調(diào)控家蠶抗菌肽的表達(dá)，以抑制其它雜菌的生長，以保護(hù)自己的營養(yǎng)和寄生需求。
　　為進(jìn)一步分析家蠶幼蟲解毒和抗氧化防御系統(tǒng)在球孢白僵菌侵染過程中的作用，我們檢測了家蠶幼蟲感染球孢白僵菌以及注射球孢白僵菌毒素之后血淋巴、中腸和脂肪體中GSTs酶活力、GSH-

16、Px酶活力、GR酶活力、GSH含量及其基因表達(dá)水平的變化，同時(shí)還檢測了注射GSH和毒素對(duì)家蠶幼蟲感染球孢白僵菌后存活率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，家蠶感染白僵菌后脂肪體、中腸、血淋巴中的GSTs、GR、GSH-Px酶活力顯著提高，各組織中Bmgstd1、Bmgsts1、Bmgsto1和Bmgsh-px的表達(dá)量在感染后期也顯著上調(diào)表達(dá)，而GSH含量卻急劇下降，說明家蠶幼蟲可以通過增加酶活力并上調(diào)解毒和抗氧化因子的表達(dá)量以增強(qiáng)抗真菌感染能力。毒素

17、注射實(shí)驗(yàn)表明家蠶幼蟲對(duì)球孢白僵菌毒素的解毒作用主要在脂肪體和血淋巴中依賴 GSTs、GR和 GSH來完成，同時(shí)定量實(shí)驗(yàn)表明Bmgsts1和Bmgsto1在注射毒素24 h后顯著上調(diào)表達(dá)，說明它們可能是家蠶幼蟲對(duì)球孢白僵菌毒素的主要解毒基因。存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GSH能夠緩解球孢白僵菌毒素對(duì)蠶體的損害，延長家蠶幼蟲的半數(shù)致死時(shí)間(約6 h)。以上結(jié)果說明，家蠶幼蟲 GSTs和 GSH-Px構(gòu)成的解毒和抗氧化防御系統(tǒng)在抗真菌感染過程中起到重要