大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細胞及其保護移植胰島功能的研究.pdf

1、目的：(1)觀察高血糖狀態(tài)下大鼠骨髓中是否存在胰島樣細胞。 (2)建立體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)的方法，確定其生物學特性。 (3)體外誘導BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島樣細胞，評估其生物學功能。 (4)探討B(tài)M-MSCs在糖尿病大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)分化為胰島素陽性細胞的潛能。 (5)觀察BM-MSCs對移植胰島功能的保護作用。 方法：(1)分別采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)或高糖誘導S

2、prague-Dawley(SD)大鼠糖尿病動物模型和一過性高血糖狀態(tài)，同齡正常SD大鼠作對照。經(jīng)密度梯度離心法分離、貼壁法培養(yǎng)原代骨髓細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關激素的表達，RT-PCR法檢測胰島相關激素、β細胞標志(GLUT-2、GK、GLP-1R)和轉(zhuǎn)錄因子(PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2)基因的表達。流式細胞術(shù)檢測胰島相關激素的陽性細胞數(shù)，以及胰島素與CD4

3、5/CD90共表達率，ELISA檢測葡萄糖刺激的胰島素分泌量(GSIS)。 (2)采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs，觀察細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，繪制生長曲線，測定對數(shù)生長期的細胞倍增時間，纖維母細胞集落形成實驗(CFU-F)檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期。采用免疫熒光法和流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD45/CD90、CD45/CD29表達及陽性率。并分別子成骨和成脂誘導分化，VonKossa染色觀

4、察成骨細胞鈣鹽沉積，油紅O染色顯示脂肪細胞脂滴形成。 (3)采用葡萄糖、尼克酰胺和exendin-4體外誘導BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島樣細胞。倒置顯微鏡和電鏡觀察誘導前后細胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，雙硫腙染色鑒定胰島樣細胞團，RT-PCR法檢測胰島發(fā)育及其功能相關基因的表達，免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察胰島相關激素的表達。流式細胞術(shù)檢測胰島素陽性細胞數(shù)和平均熒光強度，ELISA檢測GSIS。胰島樣細胞門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠

5、，觀察血糖變化。 (4)予BrdU標記分離培養(yǎng)的SD大鼠BM-MSCs，通過門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，監(jiān)測血糖變化，并通過免疫組織化學法觀察BrdU和胰島素雙陽性細胞的分布。 (5)分離培養(yǎng)SD大鼠BM-MSCs和胰島，予體外混合培養(yǎng)，檢測胰島的存活率和GSIS，評估其功能。然后予BM-MSCs聯(lián)合胰島門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，觀察血糖的變化。 結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的正常大

6、鼠骨髓細胞可以貼壁生長，單個散在或形成數(shù)個細胞克隆，呈圓形、多角形、長梭形等多種形態(tài)，未檢測到胰島相關激素的基因和蛋白表達。而一過性高血糖組和糖尿病組骨髓細胞可形成細胞團簇，表達胰島素、C肽、胰高血糖素(Gcg)、生長抑素(SS)和胰淀粉樣多肽(IAPP)蛋白，并檢測到相應激素和GLUT-2、GK、GLP-1R及PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、NKX2.2基因的表達。一過性高血糖恢復組以上基因表達消失。流式細胞術(shù)檢測顯

7、示，糖尿病組骨髓胰島素陽性細胞數(shù)為(6.9±2.9)﹪，C肽陽性細胞數(shù)為(6.6±1.3)﹪，Gcg陽性細胞數(shù)為(8.2±0.4)﹪，SS陽性細胞數(shù)為(2.3±1.1)﹪，IAPP陽性細胞數(shù)為(2.3±0.7)﹪。其中，胰島素與CD90的雙陽性細胞數(shù)為5.9﹪,胰島素與CD45的雙陽性細胞數(shù)為1.9﹪。糖尿病組骨髓細胞未檢出葡萄糖刺激的胰島素分泌。(2)BM-MSCs呈長梭形，貼壁生長，在對數(shù)生長期，細胞倍增時間約為59～67小時，細胞

8、周期G0-G1期占(76.8±4.8)﹪，增殖指數(shù)為(23.2±4.8)﹪，CFU-F檢測的集落形成能力為(140±24.2)/104細胞。BM-MSCs細胞表面CD90和CD29的陽性率分別為(96.3±1.7)﹪和(93.9±0.8)﹪，而CD45陽性率僅為(0.3±0.4)﹪。成骨和成脂誘導可以使BM-MSCs出現(xiàn)鈣鹽沉積和脂滴，分化為成骨細胞和脂肪細胞。 (3)BM-MSCs誘導培養(yǎng)過程中，細胞形成團簇狀分布，少數(shù)聚集成

9、團，直徑80～200μm，半懸浮于培養(yǎng)瓶中，雙硫腙染色陽性。電鏡顯示此類細胞胞漿內(nèi)有較多分泌顆粒。誘導后細胞表達胰島素、Gcg、SS、IAPP、GLUT-2、GK、GLP-1R、PDX-1、Ngn3、NeuroD1、PAX-6、Nkx2.2基因和胰島素、C肽、Gcg、SS、IAPP蛋白。尼克酰胺和exendin-4誘導組胰島素陽性細胞數(shù)約為20﹪，胰島素平均熒光強度增加約2.5倍，可以分泌少量胰島素，葡萄糖刺激的胰島素產(chǎn)量增加約1.5倍

10、，門靜脈移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，術(shù)后6天血糖逐步下降，12～16天血糖降至15mmol/L以下，但20天后血糖逐步上升，治療作用消失。 (4)BrdU標記的BM-MSCs的陽性率約為5～10﹪，予門靜脈和胰腺局部注射法移植治療STZ誘導的糖尿病大鼠，2周血糖無明顯變化。胰腺局部注射組2周后胰腺內(nèi)可見散在浸潤的BrdU陽性細胞，少數(shù)呈BrdU和胰島素雙陽性細胞團。門靜脈注射組2周后肝臟、胸腺、脾臟和胰腺內(nèi)均可見局部浸潤的B

11、rdU陽性細胞，但僅在胰島內(nèi)可見少數(shù)BrdU和胰島素雙陽性細胞。 (5)大鼠BM-MSCs和新鮮分離的胰島混合培養(yǎng)后，BM-MSCs呈貼壁生長，胰島半懸浮于BM-MSCs細胞層上。隨著培養(yǎng)時間的延長，胰島的存活率逐步下降?；旌吓囵B(yǎng)組第1、3、6、12天胰島的存活率明顯大于胰島單獨培養(yǎng)組(P＜0.01)。GSIS檢測結(jié)果顯示，第1天和第3天高糖可以明顯刺激胰島分泌胰島素(P＜0.01)，但隨著培養(yǎng)時間的延長，胰島對葡萄糖的反應性明

12、顯減弱，刺激指數(shù)從3.0～3.3降至1.7～1.8。第六天，體外培養(yǎng)的胰島喪失了對葡萄糖的反應性。混合培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組胰島無顯著差異。胰島移植組術(shù)后8天內(nèi)血糖可控制在15mmol/L以下，但隨后血糖逐步升高。BM-MSCs聯(lián)合胰島移植組術(shù)后血糖低于15mmol/L的時間可延長到12天，但隨后血糖亦逐步上升，治療作用消失，而BM-MSCs移植組血糖無明顯降低。 結(jié)論：(1)長期和一過性高血糖狀態(tài)均可以誘導大鼠骨髓出現(xiàn)胰島樣細胞，

13、可能是骨髓中的成體干細胞轉(zhuǎn)分化而來。 (2)體外培養(yǎng)可以獲得大量生物學特性均一的大鼠BM-MSCs，并具有成體干細胞的分化能力。 (3)大鼠BM-MSCs在體外可以誘導轉(zhuǎn)分化為胰島樣細胞。尼克酰胺和exendin-4可以有效促進BM-MSCs分化為功能性胰島素分泌細胞。 (4)BM-MSCs在糖尿病大鼠胰腺內(nèi)可以轉(zhuǎn)分化為胰島素陽性細胞，但尚不能降低糖尿病大鼠血糖水平。 (5)體外培養(yǎng)條件下，BM-MSCs