棉花抗草甘膦基因的表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、草甘膦是一種廣譜滅生性、內(nèi)吸傳導(dǎo)型的優(yōu)秀除草劑。其毒性機(jī)制主要是競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中的EPSPS合酶，導(dǎo)致莽草酸途徑中斷，芳香族氨基酸合成受阻，從而擾亂生物體的正常氮代謝最終導(dǎo)致生物體死亡。它具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、除草效果好、低毒無(wú)殘留等特點(diǎn)，是目前世界上使用面積最廣的除草劑品種。但作為一種非選擇性除草劑，它對(duì)農(nóng)作物同樣具有滅生性作用，這大大限制了草甘膦在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍。近年來(lái)，由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的大規(guī)模推廣，使得其施

2、用更加方便，也為草甘膦的應(yīng)用發(fā)展開(kāi)辟了新的途徑。目前已經(jīng)商品化的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物主要來(lái)源于美國(guó)孟山都公司。我國(guó)在該領(lǐng)域的研究起步較晚，目前還沒(méi)有自主研發(fā)的抗草甘膦作物品種進(jìn)行商品化生產(chǎn)。因此，尋找擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的草甘膦抗性基因，盡快培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的抗草甘膦作物新品種將是研究的重點(diǎn)內(nèi)容。 本研究利用從高抗草甘膦的棉花自然突變株中克隆的抗草甘膦基因，通過(guò)構(gòu)建原核載體pET-HW199，轉(zhuǎn)化工程菌株BL21(DE3)，誘導(dǎo)蛋白的表

3、達(dá)；通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體pBIHW199，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將該基因?qū)霟煵葜?，以鑒定此基因能否賦予植物對(duì)草甘膦的抗性功能。為作物的抗草甘膦基因工程提供優(yōu)良的基因源。 1.用HindⅢ、SacⅠ從載體pUCHW199上切下1.4kb的目的基因，連接到原核表達(dá)載體pET-32a(+)上，構(gòu)建重組子pET-HW199，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，再用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白。結(jié)果表明，該目

4、的基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，并且在37℃，誘導(dǎo)5小時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最大。 2.用EcoRⅠ從載體pUCHW199上切下1.3kb的目的基因片段，連接到植物表達(dá)載體pBI121上，構(gòu)建重組子pBIHW199，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草NC89，通過(guò)卡那霉素的篩選，獲得了54株T0再生植株。對(duì)得到的再生植株提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，所得到的54株抗性植株中有13株轉(zhuǎn)進(jìn)了外源抗草甘膦基因，對(duì)其作進(jìn)一步的Sout