番茄miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類大小長約20～25個核苷酸的內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。越來越多的研究表明，miRNA參與了各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括生物體發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶m

2、RNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。 雖然近年來，miRNA不斷被發(fā)現(xiàn)，但在植物中的研究還比較少，并且主要集中在全基因組已測序的雙子葉模式植物擬南芥和單子葉模式植物水稻中。番茄是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全世界各地都被廣泛的種植。番茄miRNAs的研究目前還比較少。本研究根據(jù)miRNAs的保守性，利用生物信息學(xué)計算預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，在番茄中鑒定新的miRNAs分子。 本研究利用生物信息學(xué)的方法，從miRNA數(shù)據(jù)庫中下載

3、得到擬南芥、水稻、玉米等所有植物的成熟miRNAs的序列共1300條，去除其中的重復(fù)序列后，再利用BlastN程序?qū)⑦@些miRNA序列與番茄EST、GSS序列進(jìn)行比對分析，找出與目前所有植物miRNA高度保守的番茄EST或GSS序列，接著同樣利用BlastN程序除去這些EST和GSS序列中的重復(fù)片段，同時還通過BlastX程序剔除其中的編碼序列；然后利用RNAfold程序?qū)ι鲜鍪Ｏ碌姆蔷幋a序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，找出其中具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、并

4、且成熟miRNA鏈位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一個莖區(qū)的序列作為番茄的miRNA Candidates。通過以上的步驟，本研究最后總共識別出12條番茄miRNA Candidates，其中6條來自于EST序列，另外6條來自于GSS序列。通過對這12條miRNAs序列的靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，共發(fā)現(xiàn)了29個目標(biāo)EST，其中10個靶標(biāo)EST序列是編碼已知的功能蛋白，而剩余的19個EST為未知功能序列。 為了進(jìn)一步在番茄中驗(yàn)證上述預(yù)測的12條miRNA

5、基因，本研究提取并富集6周齡番茄葉片和莖的小分子RNA，根據(jù)預(yù)測的miRNA序列，設(shè)計并合成相應(yīng)的寡核苷酸探針，利用γ-32P—ATP標(biāo)記后對這12條miRNA在番茄的葉和莖中的表達(dá)情況進(jìn)行Northern blotting分析，結(jié)果表明，其中有5條miRNA分子在番茄6周齡的葉和莖中都得到表達(dá)，而剩余的miRNA Candidates皆沒有雜交信號。原因本研究只對6周齡番茄葉和莖的小RNA進(jìn)行了研究，這些沒有雜交信號的miRNA分子可