組織激肽釋放酶對離體缺血-缺氧性損傷的影響及其機制研究.pdf

1、組織激肽釋放酶對離體缺血/缺氧性損傷的影響及其機制研究激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system,KKS)是機體重要的炎性調(diào)節(jié)系統(tǒng),廣泛分布于人及其他哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),在腦血管病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、炎癥、腫瘤等多種疾病中發(fā)揮作用。組織激肽釋放酶(tissue kallikrein,TK)是KKS的重要組成部分,主要通過其效應(yīng)物質(zhì)緩激肽(bradykinin,BK)激活Bl受體(bradykinin Bl

2、receptor,BlR)和B2受體(bradykinin B2 receptor,B2R)發(fā)揮病理生理作用。近年來越來越多的研究報道TK在腦缺血缺氧性損傷中起保護作用,但除了明確它的保護作用主要涉及到B2R及相關(guān)的信號通路外,其具體的神經(jīng)保護機制并不清楚。目前認為腦缺血缺氧性損傷的核心是各種途徑誘發(fā)的細胞內(nèi)Ca2+超載。引起缺血缺氧損傷細胞內(nèi)Ca2+超載的機制包括谷氨酸依賴的和酸敏感離子通道(acid sensing ion chan

3、nels,ASICs)等介導(dǎo)的谷氨酸非依賴的Ca2+毒性損傷途徑。那么,TK與缺血缺氧損傷中谷氨酸依賴的和非依賴的Ca2+毒性損傷機制的關(guān)系如何呢?本研究利用體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元,分別建立離體谷氨酸損傷模型、酸中毒、缺氧-酸中毒損傷模型,模擬在體缺血缺氧/再灌注過程,分別觀察TK對谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷和ASICs介導(dǎo)神經(jīng)元毒性的影響,并初步探索其機制。
　　第一部分:組織激肽釋放酶對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷的影響及其機制一

4、組織激肽釋放酶對谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷的影響
　　目的:本研究在無Mg2+的條件下,將離體培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元,暴露于100μmol/L谷氨酸(glutamate,Glu)和10μmol/L甘氨酸(Glycine,Gly)1h,然后再恢復(fù)正常培養(yǎng),建立離體神經(jīng)元Glu毒性損傷模型,模擬在體缺血/再灌注過程。觀察高濃度Glu對離體神經(jīng)元的損傷作用及TK干預(yù)對其影響。
　　方法:1.通過檢測Glu暴露后恢復(fù)正常培養(yǎng)不同時間(2

5、h,4h,6h及24h)時,釋放到上清液里的LDH量,了解Glu對神經(jīng)細胞的毒性作用;2.采用CCK-8活細胞計數(shù)試劑盒檢測神經(jīng)元的存活率,了解Glu對神經(jīng)細胞活力的影響。我們通過檢測不同濃度TK、谷氨酸受體(GluR)拮抗劑、B2R激動劑和抑制劑干預(yù)組在Glu損傷后24h時的LDH釋放率和存活率,比較它們對Glu毒性作用的影響;3.采用免疫熒光法標記成熟神經(jīng)元標記物MAP-2,觀察TK和GluR阻斷劑對Glu暴露1h后恢復(fù)培養(yǎng)3h時神

6、經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響;4.用Hoechest33342熒光核染液和TUNEL法檢測Glu暴露后24h時不同干預(yù)對神經(jīng)元凋亡的影響。
　　結(jié)果:1.LDH測定結(jié)果顯示:暴露于Glu1h后在恢復(fù)正常培養(yǎng)過程中,LDH釋放率進行性增加,TK可濃度依賴性抑制Glu暴露后24h時LDH的釋放,激活B2R和阻斷GluR也有類似作用。2.TK處理、阻斷GluR、激活B2R均能提高Glu損傷后24h時神經(jīng)元的活力。3.MAP-2免疫熒光染色顯示TK和

7、GluR抑制劑干預(yù)均能顯著抑制Glu暴露后恢復(fù)培養(yǎng)3h對神經(jīng)元形態(tài)的破壞,抑制胞體腫脹、軸突串珠樣變或斷裂等。4.Hoechest核染色和TUNEL染色的研究顯示TK、B2R激動劑和GluR阻斷劑均能降低Glu暴露后24h時神經(jīng)細胞核的固縮率和TUNEL陽性細胞率。上述TK的作用均能夠被B2R抑制劑所阻斷。
　　結(jié)論:短暫高濃度Glu暴露后恢復(fù)培養(yǎng)(再灌注)能夠誘導(dǎo)嚴重的神經(jīng)元損傷,TK預(yù)處理、激活B2R以及阻斷GluR(NMDA

8、和.AMPA受體)均能拮抗Glu誘導(dǎo)的毒性損傷,而抑制B2R能夠阻斷TK的作用。提示TK通過B2R,能夠拮抗Glu誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。二組織激肽釋放酶對谷氨酸誘導(dǎo)的氧化/硝基化應(yīng)激反應(yīng)的影響目的在離體Glu毒性損傷模型上,觀察TK對Glu誘導(dǎo)的氧化/硝基化應(yīng)激反應(yīng)的影響。方法培養(yǎng)8～10d的大鼠皮層神經(jīng)元,隨機分為正常對照、TK、B2R激動劑和抑制劑以及GluR抑制劑組,分別暴露于含Glu(100μmol/L,)和Gly(10μmol/

9、L)的無Mg2+的細胞液中,并在Glu處理前以及處理0.5h,1h,2h,5h以及6h時:1.采用DCFH-DA熒光探針標記細胞內(nèi)活性氧(ROS),在熒光顯微鏡下直接觀察細胞內(nèi)DCF綠色熒光,同時采用熒光酶標儀上,在激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm處檢測細胞內(nèi)DCF的相對熒光單位(Relative fluorescent unit,RFU),根據(jù)RFU計算出細胞內(nèi)ROS的相對含量;2.采用DAF-FM/DA熒光探針標記細胞內(nèi)一氧化

10、氮(NO),采用熒光酶標儀上在激發(fā)波長495nm,發(fā)射波長515nm處檢測細胞內(nèi)DAF-FM的RFU,根據(jù)RFU計算出細胞內(nèi)NO的相對產(chǎn)量;此外,在Glu處理2h時,提供足量一氧化氮合酶(NOS)的反應(yīng)底物L(fēng)-精氨酸,然后用DAF-FM/DA熒光探針檢測出細胞內(nèi)NO的含量,以此代表總NOS的活性,分別測定出Ca2+存在與不存在時細胞內(nèi)NO含量,以兩者之差異表示nNOS的相對活性。3.采用熒光染料Rhodamine123(Rh123)標記

11、活細胞的線粒體,用熒光酶標儀檢測出激發(fā)波長507nm,發(fā)射波長529nm處Rh123的RFU,根據(jù)RFU計算出線粒體膜電位水平(MMP)的相對水平;4.采用Ca2+敏感的熒光探針Fluo-3/AM標記細胞內(nèi)的游離Ca2+,并用熒光酶標儀檢測出激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長525nm處細胞內(nèi)Fluo-3的RFU,根據(jù)RFU計算出細胞內(nèi)游離Ca2+水平。
　　結(jié)果:1.與正常對照相比,Glu暴露(0.5h,1h,2h,5h,6h)能夠時

12、間依賴地誘導(dǎo)細胞內(nèi)ROS和NO合成增加和游離Ca2+水平升高,MMP水平降低;2.TK、BK及GluR抑制劑可顯著降低Glu損傷細胞內(nèi)ROS和NO產(chǎn)量和游離Ca2+水平,對Glu暴露2h時上述指標的影響最顯著;3.Glu暴露2h能夠顯著提高細胞內(nèi)nNOS的活性,TK、BK及GluR抑制劑干預(yù)均能抑制nNOS活性升高;4.TK的作用能夠部分被B2R抑制劑阻斷。
　　結(jié)論:TK,通過B2R,能夠拮抗Glu誘導(dǎo)氧化/硝基化應(yīng)激性損傷,降

13、低細胞內(nèi)ROS和NO的產(chǎn)量、抑制nNOS的活性、延緩線粒體膜去極化以維持線粒體膜電位水平穩(wěn)定并防止細胞內(nèi)Ca2+超載。三組織激肽釋放酶抗谷氨酸毒性作用的細胞內(nèi)信號機制目的在離體Glu毒性損傷模型上,觀察TK對Glu損傷細胞內(nèi)MAPK、PI3K/Akt及NF-κB信號通路的磷酸化蛋白表達的影響,探索TK保護作用可能涉及的細胞內(nèi)信號通路。
　　方法:1.應(yīng)用免疫細胞化學(xué)法檢測TK和GluR抑制劑干預(yù)對Glu暴露后恢復(fù)培養(yǎng)1h時磷酸化E

14、RK1/2(p-ERK1/2)表達的影響。2.采用Westernblot定量檢測Glu暴露后0h和1h時磷酸化的和總的ERK1/2、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化P38(p-P38)以及磷酸化IKKα/β(p-IKKα/β)蛋白的表達水平,并比較TK、B2R激動劑和抑制劑、GluR抑制劑及ERK通路阻斷劑PD98059干預(yù)對這些蛋白表達水平的影響。
　　結(jié)果:1.免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示正常神經(jīng)元、

15、Glu損傷神經(jīng)元和TK預(yù)處理的Glu損傷神經(jīng)元,均可見觀察到明顯的p-ERKl/2紅色熒光,但以TK預(yù)處理組的熒光強度最強。2.Westernblot定量檢測結(jié)果顯示:①各干預(yù)對p-ERK1和2表達水平的影響不同:Glu暴露1h能夠極顯著提高p-ERK1和2的表達水平至正常對照的153.7和82.4倍,Glu暴露后恢復(fù)培養(yǎng)1h時p-ERK1和2的表達水平迅速降至正常對照的6.8和20.39倍;ERK抑制劑PD98059和GluR阻斷劑幾

16、乎能夠完全阻斷Glu暴露及暴露后1h時p-ERK1/2蛋白的表達;TK預(yù)處理極顯著地增加Glu暴露神經(jīng)元p-ERK1的表達水平,在暴露后0h和損傷后1h時p-ERK1的表達水平分別為正常對照的566.8和51.06倍;阻斷B2R能夠抑制TK對p-ERK1的表達水平的影響;B2R激動劑僅能增強Glu暴露后恢復(fù)1h時p-ERK1的表達;TK和BK干預(yù)均不影響Glu暴露誘導(dǎo)p-ERK2蛋白表達的增加。②PI3K/Akt通路的Akt蛋白磷酸化水

17、平在Glu暴露時受到抑制,而恢復(fù)正常培養(yǎng)后逐漸p-Akt表達逐漸恢復(fù);雖然TK和B2R激動劑對Glu暴露后0h及1h神經(jīng)元p-Akt蛋白水平的提高作用并不顯著,但阻斷B2R能夠顯著降低TK預(yù)處理組Glu暴露后1h時的p-Akt蛋白的表達水平。③正常培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元p-P38的表達量極低,Glu暴露能顯著提高神經(jīng)細胞內(nèi)p-P38蛋白表達水平,恢復(fù)正常培養(yǎng)后,其表達水平逐漸恢復(fù);TK和BK對p-P38蛋白表達水平的抑制作用不明顯。④Gl

18、u暴露能夠提高p-JNK蛋白的表達水平,而暴露后恢復(fù)培養(yǎng)1h時,p-JNK表達水平基本回降至正常水平;TK和BK干預(yù)均能降低Glu暴露誘導(dǎo)的p-JNK蛋白表達增加;⑤正常培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元p-IKKα/β蛋白表達水平很低,暴露于Glu后p-IKKα/β表達水平明顯提高;TK預(yù)處理能促進正常神經(jīng)元和Glu暴露神經(jīng)元表達p-IKKα/β蛋白,阻斷ERK1/2信號通路可顯著降低Glu損傷后1h時p-IKKα/β蛋白的表達水平。⑥此外,激活B

19、2R或阻斷GluR對上述通路磷酸化蛋白表達水平影響與TK干預(yù)相似,而阻斷B2R則能夠顯著抑制TK對這些磷酸化蛋白表達的影響。
　　結(jié)論:1.高濃度Glu暴露能夠抑制PI3K/Akt通路激活、而促進MAPK信號通路家族和NF-κB信號通路激活。2.TK對這些信號通路有不同的影響:顯著促進NF-κB通路和ERK1/2信號途徑尤其是ERK1激活,輕微提高PI3K/Akt信號通路的活化水平,顯著抑制JNK通路而不影響P38通路的活化。激活

20、B2R能夠產(chǎn)生與TK類似的作用,阻斷B2R能夠顯著抑制TK的作用。提示,TK主要通過激活B2R,影響多條信號通路的活化狀態(tài),而產(chǎn)生抗Glu神經(jīng)毒性作用。
　　第二部分:組織激肽釋放酶對酸敏感離子通道介導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷的影響及機制一酸敏感離子通道激活對離體皮層神經(jīng)元的影響
　　目的:采用培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元,建立各種離體酸中毒損傷模型,通過觀察這些模型對神經(jīng)元的損傷作用,了解酸敏感離子通道(ASICs)激活對神經(jīng)元的影響。

21、r>　　方法:采用原代大鼠皮層神經(jīng)元,在GluR抑制劑MK801、CNQX和Ca通道阻斷劑尼莫地平以及Na通道阻斷劑TTX存在的情況下,建立缺氧復(fù)氧(Oxygenand Glucose Deprivation,OGD)、缺氧-酸中毒后再灌注(OGD-Acidosis,OGD-Ac)、持續(xù)酸中毒(continuousacidosis,C-Ac)及酸中毒再灌注(acidosis,Ac)損傷模型。通過檢測LDH釋放率,了解上述模型對神經(jīng)細胞的

22、毒性作用;采用CCK-8活細胞計數(shù)試劑盒檢測細胞存活率,了解上述模型對神經(jīng)細胞活力的影響;采用免疫細胞熒光法標記成熟神經(jīng)元標記物MAP-2,觀察暴露于OGD和OGD-Ac90min再灌注4h后神經(jīng)元的形態(tài)變化。結(jié)果在MK801、CNQX、尼莫地平以及TTX存在的條件下:1.神經(jīng)元暴露于pH6.0的酸性細胞液2h后在恢復(fù)正常培養(yǎng)(再灌注)過程中,其LDH釋放率進行性升高、存活率進行性降低,表明隨再灌注時間延長神經(jīng)元損傷進行性加重,至再灌注

23、24h時,LDH釋放率為45.6％,存活神經(jīng)元約58.6%。2.C-Ac暴露誘導(dǎo)更為嚴重的神經(jīng)元損傷,LDH釋放率升高和神經(jīng)元存活率降低更顯著,暴露24h時存活的神經(jīng)元僅10%左右;ASICs廣譜阻斷劑阿米洛利(Amiloride)或ASIC1a特異性阻斷劑狼蛛毒素1(PcTX1)均能夠抑制C-Ac暴露引發(fā)的LDH釋放增加與神經(jīng)元活力下降。3.神經(jīng)元經(jīng)OGD處理90min后在復(fù)氧(再灌注)的過程中,出現(xiàn)進行性損傷,表現(xiàn)為時間依賴地LDH

24、釋放率升高和神經(jīng)元存活率降低;而OGD-Ac處理90min后再灌注對神經(jīng)元的損傷較單純OGD處理后再灌注誘發(fā)的損傷嚴重,在同一灌注時間點其LDH釋放率更高,神經(jīng)元存活率更低;ASIC1a特異性和非特異性阻斷劑PcTX1和Amiloride均能夠顯著抑制OGD-Ac后再灌注過程LDH釋放率的升高與神經(jīng)元活力的降低。4.免疫熒光雙標法標記神經(jīng)元MAP-2和ASIC1a的研究結(jié)果顯示:與OGD損傷神經(jīng)元相比,OGD-Ac損傷神經(jīng)細胞的形態(tài)改變

25、更顯著,破壞更嚴重,神經(jīng)突起基本全部斷裂,殘存的突起也呈串珠樣變,MAP-2陽性細胞減少更顯著。結(jié)論盡管采用MK801、CNQX、尼莫地平以及TTX阻斷了親離子型谷氨酸受體、電壓依賴的Ca2+和Na+通道,阻斷了這些通道激活后誘發(fā)的細胞損傷,酸性細胞外環(huán)境(pH6.0)不僅本身能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷,而且可顯著加重缺氧復(fù)氧神經(jīng)元損傷,阻斷ASICs尤其是ASIC1a具有神經(jīng)保護作用,能夠減輕神經(jīng)元損傷,促進神經(jīng)元存活。提示我們建立的各種離體

26、酸中毒模型是有效的,ASICs尤其是ASIC1a激活介導(dǎo)了酸中毒對神經(jīng)元的損傷,產(chǎn)生了Glu非依賴的神經(jīng)毒性損傷,而阻斷ASIC1a激活有神經(jīng)保護作用。二組織激肽釋放酶對酸中毒誘導(dǎo)的離體神經(jīng)元損傷的影響目的通過觀察TK對各種離體酸中毒損傷模型引發(fā)的神經(jīng)元損傷的影響,了解TK對ASICs尤其是ASIC1a介導(dǎo)的谷氨酸非依賴的神經(jīng)毒性作用有無影響。方法采用原代大鼠皮層神經(jīng)元,在MK801、CNQX、尼莫地平以及TTX存在的情況下,建立OGD

27、、OGD-Ac、C-Ac及Ac后再灌注損傷模型,通過檢測LDH釋放率、神經(jīng)元存活率以及神經(jīng)元死亡率(PI/Hoechst染色檢測),比較TK、B2R激動劑和ASIC1a各種阻斷劑對各種模型誘發(fā)的神經(jīng)損傷的影響;采用免疫熒光雙標法標記神經(jīng)元MAP-2和ASIC1a,觀察TK對C-Ac處理3h和OGD-Ac后再灌注4h對神經(jīng)元形態(tài)和ASIC1a表達的影響;采用TUNEL染色觀察并比較TK和PcTX1對OGD-Ac損傷神經(jīng)元凋亡情況的影響。結(jié)

28、果1.LDH釋放和細胞活力檢測結(jié)果顯示TK能夠濃度依賴地降低對Ac后再灌注、C-Ac處理及OGD-Ac后再灌注損傷誘導(dǎo)的LDH釋放增加和細胞活力下降。2.PI/Hoechst染色結(jié)果提示TK處理能夠降低上述損傷誘導(dǎo)的PI陽性細胞率升高,即降低神經(jīng)元死亡率。3.ASICs廣譜阻斷劑、ASIC1a特異性阻斷劑及B2R激動劑干預(yù)對上述模型產(chǎn)生神經(jīng)損傷的保護作用與TK處理相似,而B2R抑制劑HOE140能夠降低TK的保護效應(yīng)。4.TUNEL染色

29、的結(jié)果提示TK和PcTX1均能顯著減少OGD-Ac后再灌注6h時神經(jīng)元的凋亡。5.免疫熒光雙標法的研究結(jié)果顯示:TK能夠減輕C-Ac處理3h和OGD-Ac90min后再灌注4h對神經(jīng)細胞形態(tài)的破壞,但對ASIC1a的表達量無顯著影響。結(jié)論TK能有效抑制各種單純酸中毒和缺氧-酸中毒對離體神經(jīng)元的損傷、減少神經(jīng)元死亡和凋亡并促進神經(jīng)元存活,具有ASICs阻斷劑相類似的抗酸毒性損傷的神經(jīng)保護作用。三組織激肽釋放酶對神經(jīng)元酸敏感離子通道各亞基表

30、達的影響目的觀察TK對正常神經(jīng)元和缺氧后復(fù)氧不同時間的損傷神經(jīng)元ASICs各亞基的基因水平和蛋白水平表達的影響。方法在OGD前和OGD后復(fù)氧不同時間(復(fù)氧1h、2h、3h、6h及12h)時用RT-PCR檢測ASIC1a、2a和2bmRNA表達水平;采用Western blot檢測ASIC1a、2a和2b蛋白的表達情況,同時觀察TK處理24h對正常神經(jīng)元和OGD后復(fù)氧不同時間的神經(jīng)元上述指標表達的影響。結(jié)果:1.RT-PCR檢測結(jié)果顯示:

31、正常培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元上均有ASIC1a、2a和2bmRNA表達,暴露于OGD90min后在復(fù)氧過程,ASIC1amRNA表達水平在復(fù)氧前6h緩慢下降,6h以后快速下降,至12h時達最低;ASIC2bmRNA表達水平在復(fù)氧過程緩慢進行性降低至12h時達最低;ASIC2amRNA表達在復(fù)氧初期有所增加,復(fù)氧2h后也逐漸降低。TK處理能夠降低正常培養(yǎng)神經(jīng)元和OGD損傷神經(jīng)元在復(fù)氧不同時間時ASICs各亞基mRNA的表達水平。2.Weste

32、rnblot結(jié)果顯示:ASIC1a蛋白表達,在復(fù)氧0～6h間輕微下降,在6h以后,迅速下降,至12h達最低后出現(xiàn)升高;TK預(yù)處理能顯著降低復(fù)氧0～6h和12～24h期間ASIC1a蛋白的表達水平。ASIC2a蛋白表達水平在復(fù)氧早期出現(xiàn)下降,2h時明顯升高,復(fù)氧3h以后逐漸升高,12h后再度下降。雖然TK處理能夠提高ASIC2a蛋白表達水平,但與OGD損傷組相比,差別不具有統(tǒng)計學(xué)意義。ASIC2b蛋白表達在復(fù)氧過程進行性降低,與其mRNA

33、表達水平的變化趨勢基本一致;TK干預(yù)不影響ASIC2b蛋白的表達。結(jié)論1.OGD后復(fù)氧過程中ASIC1a、2a和2bmRNA表達均出現(xiàn)降低,但其蛋白表達的變化卻不盡相同。2.TK處理顯著降低ASICs各亞基mRNA表達水平,但對各亞基蛋白表達水平的影響卻不盡相同:在復(fù)氧初期(0～6h)和后期(12～24h)顯著抑制ASIC1a蛋白表達,輕度促進ASIC2a蛋白表達,而不影響ASIC2b蛋白表達。提示TK抗酸毒性作用,在一定程度上可能與其

34、抑制ASIC1a蛋白同時促進ASIC2a蛋白表達有關(guān)。四TK對缺氧-酸中毒損傷神經(jīng)元保護作用的細胞內(nèi)信號機制目的在OGD-Ac損傷模型上,觀察細胞內(nèi)PI3K/Akt和MAPK家族各信號通路的活化情況,通過檢測TK處理對這些信號通路活化狀態(tài)的影響,了解TK對缺氧-酸中毒損傷保護作用涉及的信號通路。方法采用MK801、CNQX、尼莫地平以及TTX阻斷親離子型谷氨酸受體、電壓依賴的Ca2+和Na+通道后,建立OGD-Ac再灌注皮層神經(jīng)元損傷模

35、型。1.免疫熒光分別檢測正常和OGD-Ac90min后再灌注1h時神經(jīng)元內(nèi)p-Akt、P-JNK、P-P38和p-ERK1/2蛋白的表達。2.采用Westernblot定量檢測正常神經(jīng)元和OGD-Ac90min后再灌注0h和1h時的神經(jīng)細胞內(nèi)p-Akt、p-JNK、p-P38和p-ERK1/2蛋白及相應(yīng)的總蛋白的表達情況,并觀察TK和ASIC1a抑制劑干預(yù)對上述指標的影響。3.采用CCK-8活細胞計數(shù)試劑盒,通過檢測神經(jīng)元存活率,了解E

36、RK1/2通路阻斷劑對TK促OGD-Ac損傷神經(jīng)元存活效應(yīng)的影響。
　　結(jié)果:1.免疫熒光檢測結(jié)果顯示:p-Akt、p-JNK、p-P38和p-ERK1/2蛋白在正常神經(jīng)元上均有表達,在熒光顯微鏡下可見到相應(yīng)標記蛋白的紅色熒光,OGD-Ac90min后再灌注1h時,上述蛋白表達有所增加,在熒光顯微鏡下可觀察到更強的紅色熒光。2.Western blot定量檢測結(jié)果顯示:①OGD-Ac損傷可抑制Akt蛋白磷酸化,而損傷后再灌注可促進

37、Akt蛋白磷酸化;②TK對OGD-Ac損傷及損傷后再灌注神經(jīng)細胞內(nèi)p-Akt蛋白表達的促進作用不顯著;③正常培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元均有p-JNK、p-P38和p-ERK1/2蛋白表達,OGD-Ac暴露90min可提高p-JNK蛋白的表達水平,而對p-P38和p-ERK1/2蛋白的表達水平影響不明顯;OGD-Ac后再灌注1h時p-JNK和p-ERK1/2的表達水平均顯著提高,而p-P38表達水平依然無顯著改變。④TK預(yù)處理對OGD-Ac后再

38、灌注損傷神經(jīng)細胞內(nèi)各MAPK信號通路的影響不盡相同:TK干預(yù)顯著提高OGD-Ac損傷及損傷后再灌注1h時ERK1/2蛋白的磷酸化水平,抑制JNK蛋白的磷酸化,而不影響p-P38蛋白的表達。ASIC1a阻斷劑能夠提高p-Akt的表達水平,降低p-JNK的表達水平,并不顯著影響ERK1/2的磷酸化水平。3.CCK-8檢測結(jié)果顯示:TK和PCTX1處理均可提高OGD-Ac后再灌注4h時神經(jīng)元的活力;ERK1/2通路抑制劑PD98059,能夠顯

39、著抑制TK的促存活作用。
　　結(jié)論:1.OGD-Ac90min處理能夠抑制PI3K/Akt、促進JNK和P38信號通路激活,OGD-Ac后再灌注能夠激活PI3K/Akt、JNK和ERK1/2信號通路,對P38通路無明顯影響。2.TK處理能夠強烈促進ERK1/2信號通路激活并顯著抑制JNK通路激活,對PI3K/Akt和P38通路無明顯影響。提示TK可能通過影響ERK1/2和JNK信號通路的活化狀態(tài),減輕OGD-Ac誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷、促

40、進神經(jīng)元存活、抑制神經(jīng)元死亡和凋亡,從而減輕ASICs介導(dǎo)的缺氧-酸中毒損傷。1.組織激肽釋放酶(TK),具有抗Glu神經(jīng)毒性作用的特性,主要通過B2R,抑制Glu誘導(dǎo)的氧化/硝基化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡、促進神經(jīng)元存活。TK的作用與促進ERK1/2通路,尤其是ERK1,PI3K/Akt和NF-κB通路活化,抑制JNK通路活化有關(guān)。2.TK能夠產(chǎn)生ASICs阻斷劑類似的神經(jīng)保護作用,能夠減輕各種離體單純酸中毒模型以及缺血-酸中毒再灌注模型對神經(jīng)