槐果堿對非酒精性脂肪性肝炎防治作用的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的: 非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一個臨床病理學的概念，是指肝組織病理學上表現為肝細胞脂肪變性、肝小葉內炎癥細胞浸潤、糖原核和Mallory小體，可伴不同程度纖維化，但無明確飲酒史的一種慢性肝病，是隱源性肝硬化的重要原因，也是代謝綜合征的表現之一。關于NASH的發(fā)病機制，目前公認的“二次打擊”學說認為：初次打擊主要為胰島素抵抗，胰島素抵抗通過促進外周脂肪分

2、解和高胰島素血癥引起肝細胞脂肪變性，并啟動細胞適應程序，而脂肪變性的肝細胞活力相對不足并為氧應激提供了足夠的反應基質，結果脂肪變性的肝細胞對內外源性損害因子的敏感性增強；二次打擊主要為反應性氧化代謝產物增多，導致脂質過氧化伴細胞因子、線粒體解偶聯蛋白-2和Fas配體被誘導活化，進而引起肝組織發(fā)生炎癥、壞死甚至纖維化。NASH的發(fā)生是脂肪變性本身、氧化應激及內毒素的相互作用的結果。 NASH的治療目前尚缺乏有效藥物，由于NASH

3、的病因以肥胖、2型糖尿病、高脂血癥最為常見，故針對這些疾病的治療無疑是NASH治療的基礎。另外根據“二次打擊”學說，氧應激和脂質過氧化損傷在NASH的發(fā)病中起著重要作用，提示抗氧化治療是NASH治療的重要對策，可望阻止NASH進展，目前已有文獻報道用維生素E、甜菜堿、苦參堿、牛磺酸等具有抗氧化作用的藥物治療NASH患者可顯著降低血清轉氨酶水平，明顯減輕肝臟脂肪變性、炎癥和纖維化程度。 槐果堿是從中藥苦豆子中提取的一種苦參型生物堿

4、，結構與苦參堿類似。文獻報道，槐果堿在安全劑量下毒副作用小，其體內分布組織內濃度較血液高，且價廉，具有較好的臨床應用前景。目前研究證明槐果堿在體外可以滅活內毒素，控制內毒素通過單核一巨噬細胞系統(tǒng)在體內激活引起的炎癥反應，減輕內毒素對機體造成嚴重損害，如全身炎癥反應綜合征和多器官功能障礙綜合征等。另有報道槐果堿在體外具有顯著的抑制肝細胞分泌HBsAg、HBeAg的作用，是一個高效低毒的抗乙肝病毒的有效藥物。我們以前的研究表明槐果堿可顯著減

5、輕實驗性肝纖維化程度，改善肝功能。關于其是否具有抗NASH作用尚未見報道。本研究主要探討槐果堿對NASH的防治作用及其作用的可能機理。 研究方法: (一)大鼠實驗性NASH模型的制備 8只160g左右SD雄性大鼠，隨機分為2組，每組4只。Ⅰ組為正常組，喂飼普通飼料12周；Ⅱ組為模型組，喂飼高脂飼料(基礎飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇)12周。12周末給大鼠禁食12小時，稱量體重后予20％烏拉坦腹腔注

6、射麻醉，剖開腹腔，切取全部肝臟，觀察肝臟大體外觀。從肝右葉切取組織用生理鹽水沖洗后浸泡在10％中性緩沖福爾馬林溶液中。將福爾馬林浸泡的組織，用石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色觀察肝細胞脂肪變性程度和肝組織炎癥反應程度。對比兩組大鼠大體標本和病理結果，評估NASH模型制備情況。 (二)槐果堿對大鼠NASH的防治作用 32只180g左右SD雄性大鼠，隨機分為4組，每組8只。Ⅰ組為正常組，喂飼普通飼料12周；Ⅱ組為模型組，喂飼高

7、脂飼料(基礎飼料+100g/kg豬油+20g/kg膽固醇)12周；Ⅲ組為槐果堿預防組，喂飼高脂飼料同時予槐果堿背部皮下注射(20mg/kg體重/d)12周；Ⅳ組為槐果堿治療組，喂飼高脂飼料12周，第5周開始予槐果堿背部皮下注射。 實驗第12周末給大鼠禁食12小時，稱量體重后予20％烏拉坦腹腔注射麻醉，剖開腹腔，經下腔靜脈抽血，化驗血清血脂(Tch、TG、HDL、LDL)和肝功(ALT、AST)。切取全部肝臟，稱肝重，計算肝指數。

8、從肝右葉切取部分組織用生理鹽水沖洗后浸泡在10％中性緩沖福爾馬林溶液中，再取部分組織-70℃液氮凍存。將福爾馬林浸泡的組織，用石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE染色、V-G染色觀察肝組織炎癥反應程度和纖維沉積情況，并進行炎癥活動度(G)的分級和纖維化程度(S)的分期。部分肝組織冰凍切片行蘇丹Ⅲ染色，觀察肝細胞脂肪變性程度。用免疫組織化學方法檢測肝組織白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和轉化生長因子-α1(TGF-β1)蛋白表

9、達情況。將部分凍存組織勻漿，用RT-PCR技術檢測肝組織脂聯素(adiponectin)、瘦素(leptin)、IL-6、TNF-α、TGF-β1、a-平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和Ⅰ型前膠原(Procollagen-Ⅰ)的mRNA的表達。 (三)統(tǒng)計學處理 所有數據以均數±標準差(x±s)表示，組間比較用方差分析；病理和免疫組化分級采用秩和檢驗。統(tǒng)計結果用SPSS11.0軟件包處理，P＜0.05為差異有顯著性。

10、 研究結果: (一)大鼠實驗性NASH模型的制備 大鼠喂飼高脂飼料12周后可見其肝臟體積較正常鼠明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，表面呈奶黃色；肝臟HE染色顯示肝細胞重度脂肪變性，并可見Mallory小體，肝小葉內炎癥細胞浸潤及肝細胞點狀或融合性壞死灶。正常組大鼠肝臟未見上述改變。表明用高脂飼料能成功復制出NASH模型。 (二)槐果堿對大鼠NASH的防治作用 1.槐果堿對肝重、肝指數的影響：正常組肝重為14.

11、885±1.591g，肝指數為0.0319±0.0019；模型組肝重為18.905±2.110g，肝指數為0.0381±0.0038；槐果堿預防組肝重為14.440±1.997g，肝指數為0.0312±0.0020；槐果堿治療組肝重為15.766±1.777g，肝指數為0.0328±0.0026。模型組肝重、肝指數較正常組明顯升高(P＜0.05)，槐果堿干預組肝重、肝指數較模型組明顯下降(P＜0.05)，但預防組與治療組間無顯著性差異(

12、P＞0.05)。 2.槐果堿對肝功能的影響：正常組血清ALT為35.38±5.19 U/L；模型組為73.00±19.54U/L；槐果堿預防組為52.13±10.53U/L；槐果堿治療組為54.86±8.42 U/L。模型組血清ALT較正常組明顯升高(P＜0.05)，槐果堿干預組血清ALT較模型組明顯下降(P＜0.05)，但預防組與治療組間無顯著性差異(P＞0.05)。血清AST在槐果堿干預組與模型組間無顯著性差異(P＞0.05

13、)。 3.槐果堿對血脂的影響：正常組血清Tch、TG、HDL、LDL分別為0.56±0.239mmol/L，0.26±0.071 mmol/L，1.10±0.150 mmol/L，0.25±0.063 mmol/L；模型組分別為4.28±0.572mmol/L，0.40±0.149mmol/L，2.04±0.193mmol/L，2.85±0.512 mmol/L；槐果堿預防組分別為3.07±0.846mmol/L，0.27±0.

14、082 mmol/L，1.55±0.254mmol/L，2.31±0.669 mmol/L；槐果堿治療組分別為3.95±0.906 mmol/L，0.33±0.067 mmol/L，1.78±0.266 mmol/L，2.81±0.832 mmol/L。模型組血清Tch、TG、HDL、LDL較正常組明顯升高(P＜0.05)；槐果堿預防組血清Tch、TG、HDL較模型組明顯下降(P＜0.05)，LDL較模型組無明顯下降(P＞0.05)；槐

15、果堿治療組血清HDL較模型組明顯下降(P＜0.05)，Tch、TG、LDL較模型組無明顯下降(P＞0.05)。 4.槐果堿對組織病理的影響：HE染色顯示槐果堿干預組肝組織炎癥反應程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)；蘇丹Ⅲ染色顯示槐果堿干預組肝細胞脂肪變性程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)；V-G染色顯示槐果堿干預組肝組織纖維化程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)。預防組較治療組脂肪變性、炎癥反應、纖維化程度輕，但兩組間差異無

16、顯著性(P＞0.05)。 5.槐果堿對肝組織中細胞因子表達的影響：免疫組化顯示槐果堿干預組肝組織中IL-6、TNF-α、TGF-β1蛋白表達較模型組明顯降低(P＜0.05)。RT-PCR檢測顯示槐果堿干預組肝組織中IL-6、TNF-α、FGF-β1 mRNA表達較模型組明顯降低(P＜0.05)，Leptin、α-SMA、Procollagen-Ⅰ mRNA表達也較模型組明顯降低(P＜0.05)，而Adiponectin mRNA