致病性遲緩愛德華氏菌的鑒定、PCR檢測(cè)及esaC基因的功能鑒定.pdf

1、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性腸道菌，感染宿主范圍廣。由該菌引起的愛德華氏菌病是水產(chǎn)養(yǎng)殖最常見的傳染病之一，給水產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病大菱鲆分離和鑒定了2株遲緩愛德華氏菌，建立了致病性遲緩愛德華氏菌的PCR檢測(cè)方法，對(duì)esaC基因的功能進(jìn)行了鑒定，構(gòu)建了遲緩愛德華氏菌的三個(gè)基因缺失突變株并進(jìn)行初步鑒定，為將來用于篩選減毒活疫苗打下基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 一、遲緩愛德華氏菌的分離

2、鑒定：從兩個(gè)養(yǎng)魚場(chǎng)的發(fā)病大菱鲆分離得到了2株優(yōu)勢(shì)菌JN和MHK2。人工感染大菱鲆實(shí)驗(yàn)表明JN和MHK2對(duì)魚的半數(shù)致死濃度(LD50)分別為105.4cfu/ml和105.6cfu/ml。對(duì)JN和MHK2的16s rDNA序列分析表明，它們與遲緩愛德華氏菌的序列相似性為99％。API ID32E生理生化檢測(cè)表明，它們與標(biāo)準(zhǔn)遲緩愛德華氏菌的各項(xiàng)反應(yīng)指標(biāo)高度一致。因此將JN和MHK2鑒定為遲緩愛德華氏菌。 二、致病性遲緩愛德華氏菌的P

3、CR檢測(cè)：以遲緩愛德華氏菌的主要毒力因子-Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的裝置蛋白基因esaV、過氧化氫酶基因katB為靶基因，設(shè)計(jì)特異性引物用于遲緩愛德華氏菌PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在11株致病性菌中都檢測(cè)到了esaV和katB基因的存在；在13株非致病性菌株中均沒有檢測(cè)到esaV基因，有4株檢測(cè)到katB基因。根據(jù)上述結(jié)果，esaV基因可以作為區(qū)分致病性和非致病性遲緩愛德華氏菌的一個(gè)分子標(biāo)記。 三、esaC基因的功能鑒定：遲緩愛德華

4、氏菌T3SS的1個(gè)裝置蛋白。本研究采取基因缺失突變技術(shù)，構(gòu)建了esaC基因缺失突變株。Westemblotting分析表明，由于esaC基因的缺失，遲緩愛德華氏菌T3ss的輸送器蛋白(EseB，EseC，EseD)雖然可以正常的表達(dá)，但是不能分泌到細(xì)胞外，同時(shí)細(xì)菌的自凝聚現(xiàn)象消失。毒力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變株對(duì)藍(lán)曼龍魚的半數(shù)致死濃度(LD50)比野生型菌株提高了10倍。結(jié)果表明，esaC基因影響遲緩愛德華氏菌的毒力和T3SS相關(guān)蛋白的分泌。本研

5、究進(jìn)一步確定了esaC基因作為遲緩愛德華氏菌T3SS裝置蛋白的功能，加深了對(duì)遲緩愛德華氏菌致病機(jī)理的了解。 四、三基因缺失突變株的構(gòu)建和初步鑒定：利用基因缺失突變技術(shù)，構(gòu)建了遲緩愛德華T3SS基因esrB、T6SS(Ⅵ型分泌系統(tǒng))基因evpH、芳香族氨基酸合成酶基因aroA的三基因缺失突變株。人工感染實(shí)驗(yàn)表明，該突變株的毒力大大下降，LD50>108cfu/ml。細(xì)菌在魚體內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)表明，該突變株細(xì)菌在牙鲆魚體內(nèi)的存活時(shí)間不超過