雌激素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)在腫瘤相關(guān)性死亡病例中排在第四位,據(jù)統(tǒng)計(jì)每年約有608,700人因結(jié)直腸癌而死亡。近些年流行病學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)雌激素與結(jié)直腸癌發(fā)病有明顯的關(guān)系,在過(guò)去的幾十年里,美國(guó)結(jié)直腸癌死亡率女性患者下降明顯,有分析認(rèn)為雌激素替代療法的流行是女性患病率下降的可能原因。目前所使用的結(jié)直腸癌化療藥物的治療效果在年輕女性患者要優(yōu)于男性患者,這說(shuō)明雌激素除對(duì)女性結(jié)直腸癌患病具有

2、保護(hù)作用外,在結(jié)直腸癌治療中也有積極的作用,但確切的機(jī)制不明。最近研究報(bào)道結(jié)直腸癌患者癌組織中會(huì)出現(xiàn)miRNAs(microRNAs)表達(dá)譜的改變,包括miR-135b,miR-96,miR-183,miR-133a,miR-133b,miR-21,miR-31,miR-145,miR-203,miR-223,miR-155等,在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯增加,但是miRNAs改變的原因及表達(dá)改變后如何促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展,目前仍不清楚。已

3、有研究顯示雌激素可通過(guò)激活雌激素受體下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)miR-21表達(dá),并增加其靶基因的表達(dá)。雌激素同樣能夠影響子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)一些miRNAs的表達(dá)。雌激素受體陽(yáng)性腫瘤中雌激素的表達(dá)與miRNA表達(dá)有一定關(guān)系。因此雌激素對(duì)結(jié)直腸癌的保護(hù)作用可能與雌激素對(duì)某些miRNAs表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)。部分結(jié)直腸癌的發(fā)生與DNA錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷有關(guān),在保持遺傳穩(wěn)定方面DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)系統(tǒng)

4、發(fā)揮著很重要的作用。錯(cuò)配修復(fù)基因突變包括遺傳和散發(fā)性的突變,主要發(fā)生在致癌形成作用的早期階段。通常能夠檢測(cè)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)或涉及DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的基因主要為MLHI,MSH2,MSH6和PMS2。有研究顯示雌激素和微衛(wèi)星不穩(wěn)定存在一定的關(guān)系,可增強(qiáng)主要的錯(cuò)配修復(fù)基因(hMLH1)在結(jié)腸上皮細(xì)胞的表達(dá)。雌激素還可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。但雌激素誘導(dǎo)錯(cuò)配修復(fù)功能增強(qiáng)和結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡

5、的機(jī)制不清。
　　為了研究雌激素對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因調(diào)節(jié)的可能機(jī)制,是否有miRNAs參與,可能參與雌激素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的靶基因。我們擬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)腸癌細(xì)胞中雌激素和雌激素受體拮抗劑ICI182,780對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些miRNAs(miR-31,miR-155,miR-135b,miR-203和miR-223)表達(dá)的影響,同時(shí)在18例結(jié)直腸癌患者組織中評(píng)價(jià)血清雌激素水平與miRNA和MMR表達(dá)的相關(guān)性。通過(guò)熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)確定可能參與

6、雌激素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的基因。
　　目的：
　　1.研究結(jié)腸癌細(xì)胞中miRNA表達(dá)與雌激素的關(guān)系。
　　2.研究結(jié)腸癌細(xì)胞中MMR表達(dá)與雌激素的關(guān)系。
　　3.人體組織標(biāo)本驗(yàn)證雌激素、miRNA和MMR表達(dá)的相關(guān)性。
　　4.明確可能參與雌激素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的miRNA和靶基因。
　　研究方法：
　　1.選用三種細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),COLO205(細(xì)胞內(nèi)有較高水平的ER-β表達(dá),無(wú)ER-α)細(xì)胞

7、、SW480細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)僅有很低水平的ER-β表達(dá))和MCF-7細(xì)胞(細(xì)胞內(nèi)ER-α表達(dá)水平較高,而幾乎檢測(cè)不到ER-β表達(dá))。不同濃度雌激素處理細(xì)胞流式細(xì)胞儀測(cè)定凋亡。10nM雌激素處理COLO205細(xì)胞0h,6h,12h和24h,提取雌激素處理前后的細(xì)胞總RNA,實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155,miR-135b,miR-203和miR-223的表達(dá)水平。細(xì)胞預(yù)先加入100nM雌激素受體抑制劑6

8、h后,再加入雌激素處理12h,提取雌激素處理前后的細(xì)胞總RNA,實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b的表達(dá)。將ER-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞內(nèi),增加細(xì)胞內(nèi)ER-β的表達(dá)。收集轉(zhuǎn)染后24h和48h的細(xì)胞,提取蛋白,Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。雌激素處理轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b的表達(dá)。
　　2

9、.COLO205、SW480和MCF7細(xì)胞為研究對(duì)象,10nM雌激素處理COLO205細(xì)胞0h,6h,12h和24h,RT-qPCR和Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ER-β和MMR表達(dá)。預(yù)先加入100nM雌激素受體抑制劑6h后,再加入雌激素處理12h,提取雌激素處理前后的細(xì)胞總RNA和蛋白,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ER-β和MMR表達(dá)。雌激素處理MCF-7和SW480細(xì)胞12h后,RT-qPCR和Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ER

10、-β和MMR表達(dá)。將ER-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞內(nèi),增加細(xì)胞內(nèi)ER-β的表達(dá)后,RT-qPCR檢測(cè)雌激素對(duì)轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)hMLH1mRNA表達(dá)的影響。Westernblotting檢測(cè)雌激素對(duì)轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)hMLH1蛋白表達(dá)的影響。
　　3.共收集18例結(jié)直腸癌患者血清樣本,結(jié)直腸癌和癌旁標(biāo)本,對(duì)雌激素、miRNA和MMR表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-

11、135b抑制劑到COLO205細(xì)胞內(nèi),轉(zhuǎn)染24h后收集3h,6h,12h和24h的細(xì)胞測(cè)定凋亡,提取總RNA測(cè)定miR-135b表達(dá)。根據(jù)在線數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC(www.geome.ucsc.edu)確定LATS23′UTR,PCR在人基因組擴(kuò)增LATS23′UTR并克隆到pGL3熒光素報(bào)告載體得到pGL3-LATS23’UTRWt。同時(shí)應(yīng)用QuikChangeIIXLSite-DirectedMutagenesisKit將載體LATS23

12、’UTR序列中的miR-135b結(jié)合位點(diǎn)的核心區(qū)突變后,克隆到pGL3熒光素報(bào)告載體的熒光素酶基因下游得到pGL3-LATS23’UTRMut。分別將兩個(gè)載體與miR-135b模擬物或miR-NC共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,pGL3熒光素報(bào)告載體為對(duì)照,轉(zhuǎn)染24h后,收集細(xì)胞裂解液,用雙熒光素酶試劑盒(Promega)測(cè)定熒光素酶活性。
　　結(jié)果：
　　1.雌激素可誘導(dǎo)COLO205細(xì)胞凋亡,并存在一定劑量效應(yīng)關(guān)系。雌激素能夠

13、抑制COLO205細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b的表達(dá),并有時(shí)間依賴效應(yīng)。COLO205細(xì)胞預(yù)先加入100nM雌激素受體抑制劑6h后,能夠拮抗雌激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b表達(dá)的抑制作用。雌激素對(duì)SW480和MCF-7細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b表達(dá)無(wú)明顯抑制作用。ER-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞內(nèi),經(jīng)Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染空載組細(xì)胞內(nèi)ER

14、-β蛋白表達(dá)量無(wú)變化,而轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)ER-β蛋白表達(dá)量明顯增加。RT-qPCR結(jié)果顯示雌激素可抑制轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)miR-31,miR-155和miR-135b的表達(dá),而對(duì)空載組無(wú)影響。結(jié)果說(shuō)明雌激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些miRNAs表達(dá)的影響,可能是由雌激素受體ER-β介導(dǎo)的。
　　2.RT-qPCR和Westernblotting結(jié)果顯示,隨著雌激素處理時(shí)間的增加,細(xì)胞內(nèi)ER-β和

15、hMLH1表達(dá)增加,hMSH2表達(dá)變化不明顯。雌激素受體抑制劑可以抑制雌激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)ER-β和hMLH1表達(dá)的調(diào)節(jié)。雌激素處理MCF-7和SW480細(xì)胞12h后,細(xì)胞內(nèi)hMLH1,hMSH2和ER-β表達(dá)無(wú)明顯變化。將ER-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞內(nèi),增加細(xì)胞內(nèi)ER-β的表達(dá)后,RT-qPCR結(jié)果顯示雌激素可上調(diào)轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)hMLH1mRNA的表達(dá),而對(duì)空載組無(wú)影響。Westernblotting結(jié)果顯示

16、雌激素可上調(diào)轉(zhuǎn)染pRST7-ER-β的SW480細(xì)胞內(nèi)hMLH1蛋白的表達(dá),而對(duì)空載組無(wú)影響。雌激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)hMLH1表達(dá)的影響,可能與雌激素受體ER-β有關(guān)。
　　3.血清雌激素水平與miR-31和miR-135b表達(dá)有明顯的負(fù)相關(guān),而與miR-155表達(dá)無(wú)相關(guān)性。我們同樣發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌組織中,hMLH1mRNA表達(dá)水平與miR-155和miR-135b表達(dá)有明顯的負(fù)相關(guān),而ER-βmRNA表達(dá)與血清雌激素水平有明顯的正相關(guān)性。

17、miR-135b與血清雌激素水平,ER-β和hMLH1表達(dá)有相關(guān)性。但hMLH1表達(dá)與血清雌激素水平無(wú)明顯相關(guān)性。
　　4.miR-135b抑制劑轉(zhuǎn)染COLO205細(xì)胞,隨著細(xì)胞內(nèi)miR-135b表達(dá)降低,細(xì)胞凋亡率明顯增加。通過(guò)TargetScan和miRanda軟件分析預(yù)測(cè),熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-135b可以和LATS23’UTR結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1.雌激素能夠抑制COLO205細(xì)胞內(nèi)miRNAs(mi

18、R-31,miR-155和miR-135b)的表達(dá),上調(diào)hMLH1的表達(dá),雌激素受體抑制劑能拮抗這一作用。相比于癌旁組織,癌組織中miR-135b表達(dá)明顯增加。結(jié)腸癌組織內(nèi)miR-135b和ER-βmRNA的表達(dá)與患者血清雌激素水平有一定相關(guān)性。
　　2.當(dāng)多數(shù)病人的血清雌激素濃度低于45pg/ml時(shí),結(jié)直腸癌組織中hMLH1mRNA的表達(dá)與患者血清雌激素水平?jīng)]有明顯相關(guān)性。因此雌激素通過(guò)雌激素受體對(duì)MMR和miRNA的調(diào)節(jié)作用可