肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的噬菌體肽庫(kù)篩選.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。目前，它的治療主要以手術(shù)、化療和放療為主，患者5年生存率不到50﹪，且不能切除腫瘤的患者5年生存率為0。因而迫切需要有創(chuàng)新性、突破性的早期治療手段，而腫瘤基因療法為此提供了一條新思路。其中，以納米載體作為基因治療的運(yùn)載體，已逐漸成為此領(lǐng)域中的一個(gè)十分重要的研究方向。然而，無論是離體基因治療(ex-vivo)，還是體

2、內(nèi)基因治療(in-vivo)，都必須解決如何使納米載體攜帶的目的基因能夠靶向轉(zhuǎn)移并高效表達(dá)的問題。迄今，肝癌基因治療的效果仍然不能令人滿意，缺乏可利用的針對(duì)肝癌細(xì)胞的高靶向性分子是其重要的障礙。為此，篩選肝癌細(xì)胞特異性靶向分子，并將其與納米基因載體結(jié)合，已成為提高納米基因載體肝癌治療效果的關(guān)鍵問題之一。 為實(shí)現(xiàn)納米基因載體的腫瘤主動(dòng)靶向治療，目前主要有兩種載體表面靶向修飾的策略可被利用。第一種策略是將能與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)受體結(jié)

3、合的小分子化合物(如葉酸)作為納米載體的靶向性分子。第二種策略是通過特異性腫瘤細(xì)胞單克隆抗體完成納米載體與細(xì)胞的定向結(jié)合。近年來，用能與腫瘤組織高親和力結(jié)合的小分子肽(如RGD)作為靶分子進(jìn)行藥物靶向轉(zhuǎn)運(yùn)的成功經(jīng)驗(yàn)，已讓我們看到了在此基礎(chǔ)上發(fā)展第三種納米載體靶向腫瘤策略的希望。 為此，本文首先通過噬菌體展示肽庫(kù)，篩選獲得一批能夠與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽，并鑒定它們與肝癌細(xì)胞的結(jié)合特異性。我們的研究為進(jìn)一步研制用于治療肝癌的靶向

4、納米基因載體奠定了初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一章人肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選 目的：通過噬菌體展示肽庫(kù)，篩選人肝癌細(xì)胞結(jié)合短肽，驗(yàn)證它與肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合的能力。 方法： (1)以人正常肝細(xì)胞(L-02)為陰性消減細(xì)胞，人肝癌細(xì)胞(HepG2)為篩選靶細(xì)胞，對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)(PHD-7<'TM>)進(jìn)行全細(xì)胞消減篩選。 (2)體外篩選4輪后，隨機(jī)挑取50個(gè)陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行序列測(cè)定，并進(jìn)行短肽序列的同

5、源性分析。 (3)以EIJISA法鑒定噬菌體與HepG2細(xì)胞的結(jié)合活性，排除假陽(yáng)性或無差異結(jié)合的噬菌體。根據(jù)序列分析及ELISA鑒定的結(jié)果，選擇其中一個(gè)具有較高親合力的噬菌體克隆進(jìn)行結(jié)合特異性的分析。 結(jié)果： (1)經(jīng)過4輪體外篩選，可見噬菌體在靶細(xì)胞HepG2上出現(xiàn)明顯富集。結(jié)果表明，回收噬菌體的滴度由第一輪的0.6x10<'4>pfu增加到第四輪的5.856x10<'6>pfu，增加了976倍；同時(shí)，回收率也

6、顯著提高，由第一輪的0.3×10<'-7>增至第四輪的292.8×10<'-7>。相對(duì)而言，對(duì)照細(xì)胞L-02的回收率則由第一輪的3.48×10<'-7>降至第四輪的0.61×10<'-7>。 (2)以藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)隨機(jī)挑取50個(gè)攜帶噬菌體的大腸桿菌克隆，經(jīng)測(cè)序得到各噬菌體單克隆的多肽插入序列(S1～S50)，其中，編號(hào)為S1的克隆重復(fù)14次，S4重復(fù)13次，S13重復(fù)8次，S8重復(fù)3次，S9、S14各重復(fù)2次，S20出現(xiàn)1次，因而最

7、終產(chǎn)生7條核苷酸序列，分別為S1、S4、S13、S8、S9、S14、S20。根據(jù)氨基酸密碼子，將上述插入序列翻譯成氨基酸，即為噬菌體展示短肽+HCBP(Hepatoma，Cells Binding Peptide)。分別被命名為HCBP1、HCBP4、HCBP13、HCBP8、HCBP9、HCBP14，HCBP20。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，在已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中未發(fā)現(xiàn)與這些短肽序列完全一致或具有較好同源性的蛋白質(zhì)分子。 (3)酶聯(lián)免

8、疫分析(ELISA)鑒定顯示，上述幾個(gè)陽(yáng)性克隆在HepG2細(xì)胞和L-02細(xì)胞上有差異性結(jié)合，其中S1噬菌體克隆對(duì)兩種細(xì)胞的結(jié)合差異性最大。結(jié)合測(cè)序分析，本文選擇S1噬菌體克隆做進(jìn)一步鑒定。 第二章：HCBP1結(jié)合短肽特異性的鑒定 目的：分析S1噬菌體克隆及人工合成短肽HCBP1與肝癌細(xì)胞結(jié)合的特異性。 方法： (1)通過體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定S1噬菌體克隆與肝癌細(xì)胞結(jié)合的特異性；通過免疫組織

9、化學(xué)染色，鑒定S1噬菌體克隆與人肝癌組織結(jié)合的特異性。 (2)人工合成該噬菌體所呈現(xiàn)的短肽，采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)證明合成短肽對(duì)噬菌體與靶細(xì)胞結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。 (3)利用免疫熒光技術(shù)觀察人工合成肽HCBP1與肝癌細(xì)胞的結(jié)合特異性。 結(jié)果： (1)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色均顯示，S1噬菌體克隆對(duì)肝癌細(xì)胞的結(jié)合靶向性明顯高于對(duì)照細(xì)胞，并能與肝癌組織特異性結(jié)合。 (2)競(jìng)爭(zhēng)

10、ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，S1噬菌體克隆與HepG2細(xì)胞的結(jié)合能被其插入序列的人工合成肽HCBP2競(jìng)爭(zhēng)抑制。 (3)免疫熒光顯色證實(shí)，F(xiàn)ITC-HCBP1能特異性地結(jié)合于肝癌細(xì)胞的胞膜及核周胞漿。 結(jié)論： (1)本實(shí)驗(yàn)獲得了7個(gè)在}tepG2細(xì)胞、L-02細(xì)胞上有差異性結(jié)合的噬菌體克隆(S1、S4、S13、S8、S9、S14、S20)，并證實(shí)S1噬菌體克隆所呈現(xiàn)的七肽HCBP1能與靶細(xì)胞高親合性結(jié)合。 (2)本