本氏煙抗疫病轉(zhuǎn)錄因子的篩選及兩個(gè)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的抗病功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor)一般與啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)控目的基因在特定時(shí)空的表達(dá)。根據(jù)其DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，DBD)可劃分為不同的家族，包括AP2/ERF家族、WRKY家族、MYB家族、NAC家族等。植物中的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育、應(yīng)答病原菌侵染等多種生物過(guò)程中起重要作用。研究植物中抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)獲得新的抗病基因和了解植物抗病發(fā)生過(guò)程均有重要意義。本研究

2、通過(guò)分析本氏煙與寄生疫霉互作轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)篩選到18個(gè)參與本氏煙的抗疫霉過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子;進(jìn)一步通過(guò)基因同源比對(duì)的方法獲得了兩個(gè)抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并初步研究了其參與本氏煙抗病的機(jī)制。
　　本氏煙中抗疫霉轉(zhuǎn)錄因子的篩選:為了尋找在本氏煙抗疫霉菌過(guò)程中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，選擇經(jīng)過(guò)寄生疫霉(Phytophthora parasitica)侵染6h的本氏煙葉片，以未經(jīng)處理的葉片為對(duì)照，建立本氏煙與寄生疫霉互作的轉(zhuǎn)

3、錄組數(shù)據(jù)表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)分析本氏煙在疫霉誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，有235個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因受疫霉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，參照已報(bào)道的擬南芥或普通煙中受病原菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，從中挑選了71個(gè)同源的上調(diào)表達(dá)4倍以上的基因，通過(guò)qRT-PCR的方法驗(yàn)證挑選基因的表達(dá)模式，最終獲得18個(gè)表達(dá)4倍以上的基因，推測(cè)這18個(gè)基因可能直接參與本氏煙的抗疫霉過(guò)程。
　　本氏煙NbWRKY40轉(zhuǎn)錄因子的抗病功能研究:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道中擬南芥(Ar

4、abidopsis thaliana)和普通煙(Nicotiana tabacum)中具有抗病及抗脅迫功能的Ⅱa亞類WRKY40轉(zhuǎn)錄因子的序列，通過(guò)本氏煙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及基因同源克隆法，獲取本氏煙中的NbWRKY40基因。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)該基因受疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的情況，結(jié)果顯示該基因受疫霉誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。為了探究該基因在本氏煙中的抗病相關(guān)功能，利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus-induced gene silencing，VI

5、GS)，分別用半活體營(yíng)養(yǎng)型寄生疫霉和死體營(yíng)養(yǎng)型灰霉菌作為測(cè)試菌株，檢測(cè)基因沉默對(duì)本氏煙抗性指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，沉默Nb WRKY40基因降低了本氏煙對(duì)疫霉菌的抗性，同時(shí)細(xì)胞學(xué)觀察表明，在接種點(diǎn)附近菌絲積累量增加、細(xì)胞壞死程度增強(qiáng)，過(guò)氧化氫積累和胼胝質(zhì)沉積都明顯減少。而該轉(zhuǎn)錄因子沉默也降低了本氏煙對(duì)灰霉菌的抗性。進(jìn)一步檢測(cè)NbWRKY40基因沉默對(duì)抗病信號(hào)通路相關(guān)基因PR1b、PR2b，LOX, ERF1的表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，NbW

6、RKY40基因沉默導(dǎo)致參與抗病和SA途徑的PR1b、PR2b基因的疫霉誘導(dǎo)表達(dá)能力明顯下降。推測(cè)Nb WRKY40基因可能依靠SA介導(dǎo)的信號(hào)通路參與調(diào)控本氏煙抗病性。
　　本氏煙NbWRKY1轉(zhuǎn)錄因子抗病相關(guān)功能研究:參考文獻(xiàn)報(bào)道以及本氏煙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在本氏煙中獲得一個(gè)Ⅰ亞類的NbWRKY1基因，采用VIGS的方法來(lái)研究其在本氏煙中的抗病功能。結(jié)果顯示，沉默NbWRKY1基因會(huì)降低本氏煙對(duì)于寄生疫霉和灰霉菌的抗性，對(duì)寄生疫霉菌的侵