棉鈴蟲神經(jīng)肽allatotropin G蛋白偶聯(lián)受體的克隆和鑒定.pdf

1、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）屬于鱗翅目夜蛾科（Lepidoptera Noctuidae），在世界各地廣泛分布，是我國和世界農(nóng)業(yè)的主要害蟲之一。昆蟲神經(jīng)肽促咽側體素(allatotropin，AT)主要調控保幼激素的合成，進而調控昆蟲的生長、發(fā)育及生殖。昆蟲神經(jīng)肽的受體主要為G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，把胞外信號傳遞到胞內，對昆蟲的生長、發(fā)育、生殖、免疫、代謝及行為等起重要的調控作用，GPCR一直是綠色農(nóng)藥研發(fā)最主

2、要的藥靶。因此，對棉鈴蟲的allatotropin的GPCR進行克隆和鑒定，為進一步把這些新型配體開發(fā)成控制棉鈴蟲生長發(fā)育的綠色農(nóng)藥建立基礎。
　　利用RACE方法，克隆獲得棉鈴蟲allatotropin(Har-AT)受體基因(Har-ATR)全長cDNA序列，棉鈴蟲ATR的ORF為1341bp，編碼466個氨基酸，5'端非編碼區(qū)長236bp，3'端非編碼區(qū)長341bp。棉鈴蟲ATR包含G蛋白偶聯(lián)受體典型的7次跨膜結構域，與鱗翅

3、目其他昆蟲的ATR相一致。系統(tǒng)發(fā)育分析表明棉鈴蟲ATR與煙草天蛾ATR處于同一分支，且與煙草天蛾的氨基酸同源性為72.2％。
　　利用定量PCR技術，明確了棉鈴蟲allatotropin及受體基因的組織分布和發(fā)育表達。Har-AT在胸腺中表達最高，其次是腦，在中腸與脂肪體中不表達。而Har-ATR在腦中表達量最高，在各組織均有表達。在腦組織中，Har-AT在蛹8天表達量最高，其次為蛹10天;Har-ATR在5齡幼蟲第2天表達量最高

4、，其次為蛹10天，與Har-AT發(fā)育表達模式稍有差別。
　　構建并獲得含Har-ATR的ORF的pcDNA5重組質粒(pcDNA5FRT-HATR)，轉染到CHO-WT11細胞株，與棉鈴蟲4種AT進行結合活性分析。4種AT與HATR均引起細胞內Ca2+水平的增加，呈現(xiàn)特異性的響應關系。Har-AT、Har-ATL-Ⅰ、Har-ATL-Ⅱ、Har-ATL-Ⅲ的EC50值分別為6.9364×10-5 mM、2.8744×10-7mM、

5、1.3061×10-6mM和2.38×10-3 mM。上述結果證明我們克隆的Har-ATR是Har-AT的受體，Ca2+是Har-ATR的信號通路中的第2信使;與Har-ATR結合活性最高的為Har-ATL-Ⅰ的，其次是Har-AT和Har-ATL-Ⅱ，Har-ATL-Ⅲ最低?？紤]到細胞株對受體的鑒定影響較大，把pcDNA5FRT-HATR轉染到HEK293細胞株中，4種Har-AT與HATR均引起細胞內Ca2+水平的增加，呈現(xiàn)特異性的

6、響應關系;HEK293細胞株中結合的活性略低于CHOWT11細胞株，但是結合活性的順序與CHOWT11細胞株一致。
　　進一步測驗是否配體與Har-ATR的結合激活，是否會導致細胞內cAMP水平的改變。把pcDNA5-Har-ATR或pcDNA5空質粒轉染到HEK細胞株中，結果顯示配體和Har-ATR結合后cAMP響應不明顯，因此cAMP并非Har-AT激活Har-ATR的主要第2信使通路，Ca2+是Har-ATR的信號通路中主要

7、的第2信使。
　　前面的結果顯示Har-AT主要的配體是Har-ATL-Ⅰ、Har-AT和Har-ATL-Ⅱ，合成3個配體的C端的5個氨基酸模擬肽（命名為AT、ATL1和ATL2），利用CHOWT11細胞株檢測3個模擬肽與HATR的結合活性。ATL1和HAR-ATR結合后引起的Ca2+的響應較弱，ATL1與Har-ATR結合的EC50值為2.16×10-3mM，與Har-ATLⅢ的結合活性相當，AT和ATL2與Har-ATR的結合